RNAi沉默Stat1基因对胶质瘤细胞FAT10表达的影响

李少一 王志超 高 芸 李晓东 张明杰 马维宁 刘云会

(中国医科大学附属盛京医院神经外科，辽宁 沈阳 110041)

1996年，FAT10在人类的Ⅰ类主要组织相容性复合体(MHCⅠ类)区域被发现〔1〕，此后FAT10被报道与肝癌的发生密切相关，在90%以上的肝癌过表达，而在毗邻的非肝癌组织中FAT10在转录水平和蛋白水平均检测不到〔2〕。近期的研究显示，FAT10在胶质瘤中也存在过表达现象〔3〕，并与胶质瘤的进展与预后不良密切相关，在老年人群中尤为明显。FAT10，又称双泛素，由165个氨基酸残基组成，分子量18 kD，属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白(UBLs)，由两个泛素样部分前后融合而成〔4，5〕。FAT10的功能涉及很多方面，包括信号转导、蛋白移位和细胞周期调节等。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基、OPTI培养基、胎牛血清，购自Invitrogen公司，RIPA细胞裂解液购自北京百泰克生物科技公司，FAT10、Stat1单克隆抗体购自Santa Cruz公司，兔抗鼠IgG抗体购自Pierce公司，Stat1 siRNA购自Sigma公司。人胶质瘤细胞株U251购自ATCC公司。

1.2 序列分析 FAT10转录起始点上游的启动子及其上游调控区的2 500bp序列从ENSEMBL数据库(http://www.ensembl.org/)下载，采用 TRANSFAC数据库(Version 8.3)在线预测FAT10基因上游调控序列的(http://alggen.lsi.upc.es/)转录因子结合位点。

1.3 电穿孔转染 离心收集细胞，重悬细胞于OPTI培养基中，调整细胞密度至1×107细胞/ml，加入1 μg的Stat1 siRNA混匀后移入2 mm电转杯，电击条件为120 V，20 ms，将细胞分3份转入6孔培养板放入培养箱培养，用于后续实验。

1.4 细胞TNF-α处理 Stat1干扰组及阴性对照组电穿孔转染24 h后，给予50 ng/ml的TNF-α刺激8 h后收集细胞用于Western印迹检测。而核型分析实验中，经电穿孔转染24 h和50 ng/ml的TNF-α刺激8 h后，更换为普通培养液，2 d后重复进行电穿孔和TNF-α刺激，重复5次后收集细胞进行核型分析。

1.5 Western印迹检测 用RIPA细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，变性处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入单抗4℃过夜后，再加1∶1 000稀释的HRP标记的二抗，室温孵育30 min，经PBST清洗3次，ECL发光显影。

1.6 核型分析 收集各组细胞，经0.075 mol/L的KCl室温下低渗30 min处理后，用新配制的甲醇∶冰醋酸(3∶1)于-20℃固定2 h，采用冷片法滴片，空气干燥过夜。干燥后的染色体玻片用Giemsa染液染色10 min，选取50个染色体中期分裂相进行染色体计数。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件分析数据。

2 结果

2.1 FAT10基因启动子区的炎性转录因子结合位点的预测采用生物学软件预测了FAT10基因-2 500～+250区段，核因子(NF)-κB、Stat1、Stat3炎性转录因子的结合位点。结果见图1，其中NF-κB结合位点7个，Stat1结合位点7个，Stat3结合位点3个。

图3 核型分析

图1 FAT10上游－2 500～+250区段假定炎性因子结合位点

2.2 Stat1小干扰RNA沉默效率及FAT10蛋白水平检测Western印迹结果显示，经TNF-α刺激后FAT10蛋白表达量升高明显。与阴性对照组(si Ctr)和空白对照组比较，Stat1干扰组(si Stat1)Stat1的蛋白表达水平下降，说明进行siRNA干扰后，有效抑制了U251细胞中Stat1的表达。而TNF-α诱导的FAT10高表达，在Stat1干扰组也明显降低，表明通过抑制Stat1可以有效抑制TNF-α诱导的FAT10高表达。见图2。

2.3 核型分析 对各组处理细胞的中期分裂相染色体的观察表明:对照组U251细胞(Ctr)正常二倍体染色体数目为60～69，占计数细胞总数的85%;而经过TNF-α处理后的U251细胞(TNF-α/si Ctr)的正常二倍体染色体比例下降到37.5%(与对照组比较有显著差异，P＜0.01);而Stat siRNA干扰组U251细胞(TNF-α/si Stat1)正常二倍体染色体比例接近对照组，为80%(与TNF-α处理组比较有显著差异，P＜0.01)。见图3。结果提示，TNF-α可以诱导非整倍体的出现，而采用si Stat1沉默Stat1后，可以通过有效抑制TNF-α诱导的FAT10高表达而阻断TNF-α诱导的U251细胞的核型异常。

3 讨论

现代细胞遗传学和分子生物学研究证明，大多数肿瘤细胞特别是实体瘤细胞核体外转化细胞，常表现为染色体不稳定(CIN)，非整倍体是主要表现形式之一，即整条染色体的获得或者缺失。Duesberg研究发现，非整倍体的出现，可以通过破坏细胞周期检测点和平衡机制，导致细胞癌变〔6，7〕。

FAT10作为类泛素家族成员，被发现在肝癌、胶质瘤、大肠癌等恶性肿瘤中表达增高〔2，3，8〕，但在肝癌的发生发展中起着重要作用，但具体作用机制还不很清楚。FAT10作为重要炎性因子TNF-α下游因子，有报道显示，FAT10通过与MAD2(mitotic arrest deficient 2)非共价结合〔2，4〕，导致染色体不稳定。MAD2是保证染色体向两极移动的重要的物质基础，其在着丝粒上的缺乏，可能导致部分染色体分离异常〔9〕。在细胞有丝分裂的前、中期，高表达的FAT10可以降低定位在着丝粒上的MAD2，导致染色体不分离和染色体不稳定，出现非整倍体细胞。本研究结果显示，siRNA干扰有效抑制U251细胞中Stat1的表达后，可以通过抑制Stat1有效抑制TNF-α诱导的FAT10高表达，进而通过有效抑制TNF-α诱导的FAT10高表达而阻断TNF-α诱导的非整倍体现象。FAT10作为重要炎性因子TNF-α下游因子，具有参与慢性炎症相关性肿瘤发生发展的潜能，解析TNF-α/NF-κB/FAT10路径调控肝癌发生发展进程的分子机制，有助于进一步寻找有效的胶质瘤治疗靶标。

图2 Stat1和FAT10的蛋白表达结果

1 Fan W，Cai W，Parimoo S，et al.Identification of seven new human MHC class I region genes around the HLA-F locus〔J〕.Immunogenetics，1996;44(2):97-103.

2 Lee CG，Ren J，Cheong IS，et al.Expression of the FAT10 gene is highly upregulated in hepatocellular carcinoma and other gastrointestinal and gynecological cancers〔J〕.Oncogene，2003;22(17):2592-603.

3 Yuan J，Tu Y，Mao X，et al.Increased expression of FAT10 is correlated with progression and prognosis of human glioma〔J〕.Pathol Oncol Res，2012;18(4):833-9.

4 Ren J，Kan A，Leong SH，et al.FA10 plays a role in the regulation of chromosomal stability〔J〕.J Biol Chem，2006;281(16):11413-21.

5 Pierron R.Magnetic resonance imaging in the evaluation of knee injuries〔J〕.South Med J，1992;85(7):783.

6 Schäfer M，Werner S.Cancer as an overhealing wound:an old hypothesis revisited〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2008;9(8):628-38.

7 Li R，Sonik A，Stindl R，et al.Aneuploidy vs.gene mutation hypothesis of cancer:recent study claims mutation but is found to support aneuploidy〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(7):3236-41.

8 Lukasiak S，Schiller C，Oehlschlaeger P，et al.Proinflammatory cytokines cause FAT10 upregulation in cancers of liver and colon〔J〕.Oncogene，2008;27(46):6068-74.

9 Wang X，Jin DY，Wong YC，et al.Correlation of defective mitotic checkpoint with aberrantly reduced expression of MAD2 protein in nasopharyngeal carcinoma cells〔J〕.Carcinogenesis，2000;21(12):2293-7.