端粒酶在整倍体与非整倍体细胞中的表达差异

胡腾惠 徐兴祥

端粒是位于真核生物染色体末端的线性结构，具有抑制染色体末端进行重组及融合的功能，从而维持染色体的稳定性，端粒在细胞复制的过程中会不断缩短，而端粒酶能够维持端粒长度，从而促使细胞不断进行复制[1]。研究表明，超过90%的恶性肿瘤具有端粒酶活性，而在正常细胞与组织中，则只能在淋巴细胞、造血细胞、生殖细胞等具有增殖潜能的细胞中检测到端粒酶活性[2-4]。这就充分表明端粒酶可以作为一种肿瘤分子标志物来进行广泛应用。非整倍体是指个别染色体减少或增加一条或几条而导致染色体数目非整倍数，所以称为非整倍体，是细胞分裂时染色体分离、染色体丢失、染色体易位异常的结果。非整倍体严重威胁人类的健康：某些先天性畸形综合征、自发性流产、死胎形成的主要原因就同非整倍体相关，90%的实体瘤和50%的血液肿瘤也是非整倍体所致[5]。研究发现，端粒酶及非整倍体在肿瘤的发生发展中起重要作用，但端粒酶在整倍体与非整倍体细胞中的表达是否具有差异，端粒酶抑制剂叠氮脱氧胸苷(azidothymidine, AZT)对整倍体和非整倍体细胞端粒酶hTERT基因的表达及活性有何影响，目前尚不清楚，本研究拟对这些问题进行探讨。

材料和方法

一、实验材料

人HCT116细胞来源于苏北医院实验中心，胎牛血清购于杭州四季青公司，AZT购于TCI公司，盐酸强力霉素及吉姆萨染液购于索莱宝公司，nocodazole及Eukitt® 快速硬化封片剂购于sigma公司，MG132购于selleckchem公司，端粒酶活性试剂盒购于Roche公司，MAD2L1购于R&D Systems公司。

二、实验方法

取人HCT 116细胞培养于含10%灭活胎牛血清、100 U/ml青链霉素DMEM 培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。取处于对数生长期的HCT116细胞加入1/1 000的0.2 mg/ml 盐酸强力霉素(doxycycline)，作用16 h后，撤掉盐酸强力霉素，设为非整倍体组，并设立不加盐酸强力霉素的HCT116细胞作为对照组，称为整倍体组，撤药当天为第1天，在撤药后第11天，采用0、100、250 μmol/L的AZT处理两组细胞72 h，设立空白对照组和AZT处理组。

1. 检测指标： 在盐酸强力霉素撤掉后第6、8、11天检测整倍体组和非整倍体组细胞hTERT基因及端粒酶活性。在撤药后第11天对整倍体组和非整倍体组细胞进行染色体滴定，取撤药后第3天、第6天、第11天的细胞，检测MAD2L1蛋白表达，检测AZT处理组hTERT mRNA基因及端粒酶活性表达。

2. hTERT mRNA基因表达： 在撤药后第6、8、11天采用RT-PCR检测整倍体组和非整倍体细胞中hTERT mRNA基因表达差异，RT-PCR检测空白对照组及其AZT处理组hTERT mRNA基因的表达hTERT正向引物：5′-AAGTTCCTGCACTGGCTGATG-3′，反向引物：5′-GCTTTGCAACTTGCTCCAGAC-3′。使用GAPDH作为内参。按照RNA提取步骤提取总RNA，采用酶标仪进行定量，逆转录反应采用thermo逆转录试剂盒，逆转录完毕后，采用vazyme公司的SYBR Green荧光定量试剂，进行荧光定量扩增。设置反应体系为95.0 ℃ 5 min，95.0 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s共40个循环，95.0 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，95.0 ℃ 15 s终止反应。

3. 端粒酶活性检测： 在撤药后第6、8、11天采用端粒酶活性试剂盒(TRAP-PCR-ELISA)对整倍体组和非整倍体组细胞端粒酶活性进行检测，采用0、100、250 μmol/L的AZT处理两组细胞72 h后，采用TRAP-PCR-ELISA检测端粒酶活性的变化。收集待测细胞(2.5×103个)，制备端粒酶提取液，并进行PCR扩增。PCR条件：引物延伸 25 ℃ 15 min，端粒酶灭活 94 ℃ 5 min，扩增共30个循环：变性 94 ℃ 30 s，退火 50 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 90 s。72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存 PCR 产物。取扩增产物2.5 μl，进行ELISA反应。从酶标仪上读取其在 450 nm 处的 OD 值，以690 nm处作为参考波长。端粒酶活性(RTA)计算公式为RTA=(AS-ASO)/AS.IS/[(ATS8-ATS8.0)/ATS8.IS]×100%，ΔA=AS-ASO，若ΔA大于两倍的ASO则判定为端粒酶阳性；AS：样品吸光度；ASO：热处理后样品吸光度；AS.IS︰IS样品吸光度；ATS8：对照模板吸光度；ATS8.0：裂解液吸光度；ATS8.IS：对照模板的IS吸光度；由试剂盒提供阳性对照(为含有端粒重复序列的DNA片段)，阴性对照为将端粒酶提取物在85 ℃环境中处理10 min。

4. 染色体滴定： 取撤药后生长至第11天的整倍体组和非整倍体组细胞加入80 ng/ml的有丝分裂抑制剂nocodazole和10 μmol/L的蛋白酶抑制剂MG132，在37 ℃孵箱中孵育6 h后，按照染色体滴定的步骤进行处理，然后滴于玻片上，待玻片晾干后使用吉姆萨染液进行染色，待晾干后采用Eukitt® 快速硬化封片剂进行封片，封片后在100×的油镜下进行观察计数，选取150个细胞进行拍照并对其染色体数目进行计数。将染色体数目为45条或46条定义为整倍体(根据ATCC细胞库中关于HCT116细胞染色体核型的描述)，将染色体数目不是45或46条的细胞定义为非整倍体。

5. MAD2L1蛋白表达测定： Western blot 检测两组细胞撤药后第3天、第6天、第11天MAD2L1蛋白表达变化。在撤药后第3天、第6天、第11天分别收集整倍体组和非整倍体细胞，采用裂解液裂解细胞后获得总蛋白。采用bio-rad法于575 nm处测定总蛋白浓度。然后，配制12%的SDS-PAGE分离蛋白样品，上样量60 μg，采用PVDF膜进行转膜，恒压2 h，5%的脱脂奶粉封闭1.5 h，一抗MAD2L1(1︰200稀释)4 ℃封闭过夜。TBST洗涤3次后，室温孵育二抗(1︰2 000稀释)1 h，采用ECL化学发光剂进行显色，采用凝胶成像系统进行显影并拍照。目的蛋白的灰度值与内参α-Tublin灰度值的比值代表样品中目的蛋白的相对含量。

三、统计学方法

所有数据采用SPSS18.0进行统计学分析，两样本均数比较采用t检验，两独立样本率比较采用χ2检验，组内比较及组间比较采用双因素方差分析，P<0.05为具有统计学差异。

结 果

一、染色体滴定

整倍体组中的150个细胞中，有10个是非整倍体，其整倍体率为93.3%，在非整倍体组的150个细胞中，共有117个细胞为非整倍体，非整倍体率为78%，见表1。

表1 整倍体组和非整倍体组细胞第11天染色体滴定结果比较

二、MAD2L1蛋白表达

在加入盐酸强力霉素第3天后非整倍体组MAD2L1蛋白表达明显下降，两组比较具有统计学差异(P<0.05)。第6天时，MAD2L1逐渐恢复，第11天时，MAD2L1完全恢复正常，见图1。

三、 撤药后第6、8、11天hTERT mRNA基因表达及端粒酶活性

整倍体组和非整倍体组细胞在第6、8、11天hTERT mRNA基因的表达量分别为(1︰1.19±0.05、1︰1.21±0.02、1︰1.46±0.04)。非整倍体hTERT mRNA基因表达明显高于整倍体，两组细胞在第6、8、11天比较具有统计学差异(P<0.05)。整倍体组和非整倍体组细胞在第6、8、11天端粒酶活性分别为(2.87±0.01︰3.14±0.10、2.89±0.01︰3.25±0.03、2.79±0.03︰4.26±0.15)，非整倍体组细胞的端粒酶活性明显高于整倍体，两组细胞在第6、8、11天比较具有统计学差异(P<0.05)，见图2。

图1 加入盐酸强力霉素后不同时间MAD2L1蛋白的表达变化

图2 hTERT基因表达及端粒酶活性；注：A：整倍体组和非整倍体组细胞hTERT基因表达；B：整倍体组和非整倍体组细胞第11天端粒酶活性比较

四、AZT处理后hTERT mRNA基因表达及端粒酶活性

采用100、250 μmol/L的AZT作用整倍体和非整倍体细胞后，两组细胞hTERT mRNA基因表达及端粒酶活性均出现不同程度的下降。与空白对照组相比，整倍体组hTERT mRNA基因表达在250 μmol/L处具有统计学差异(P<0.05)；端粒酶活性表达在100、250 μmol/L处具有统计学差异(P<0.05)。与空白对照组相比，非整倍体组hTERT mRNA基因表达及端粒酶活性在100、250 μmol/L处均具有统计学差异(P<0.05)。非整倍体组hTERT mRNA基因及端粒酶活性下降程度较整倍体组更明显，整倍体组细胞在100、250 μmol/L处的hTERT mRNA基因下降率分别为5%、32%，端粒酶活性下降率为14.69%、25.40%；非整倍体组细胞在100、250 μmol/L处的hTERT mRNA基因下降率分别为38.46%、51.28%，端粒酶活性下降率为17.00%、54.27%，两组细胞hTERT mRNA基因下降率在100、250 μmol/L处具有统计学差异(P<0.05)。两组细胞端粒酶活性下降率在250 μmol/L处具有统计学差异(P<0.05)。见图3。

图3 hTERT基因表达及端粒酶活性；注：A：不同浓度AZT作用后hTERT基因表达情况；B：不同浓度AZT作用下端粒酶活性表达情况

讨 论

非整倍体与肿瘤形成之间的关系一直以来备受关注，一些研究者认为非整倍体只是肿瘤形成过程中的一个产物，另外一些研究者认为非整倍体可以促进肿瘤形成。Duesberg等[6]提出的非整倍体假说认为，非整倍体可以促进肿瘤形成，他认为致癌物使细胞形成非整倍染色体，非整倍体导致有丝分裂相关基因异常表达，产生异常数目的中心粒及异常比例的纺锤体。不均衡的纺锤体可引起有丝分裂过程中染色体的随机获得或丢失，非整倍染色体随机分配到子代细胞中，经过不断的恶性循环，非整倍体催化自身细胞核型的不断变化及进化，最终产生肿瘤细胞核型。大量研究发现非整倍体可以促进肿瘤形成，具有3条8号染色体会促进血液方面的肿瘤发生，25%的慢性粒细胞白血病及10%～15%的急性粒细胞白血病以及5%的急性淋巴细胞白血病患者都会出现3条8号染色体[7-9]。

研究表明一系列细胞压力因子可以导致非整倍体的形成[10-11]，Meena等[3]通过采用慢病毒敲除GJB3、RXFP1(LGR7)、OSBPL、STARD9等基因获得非整倍体，这些基因与肿瘤形成及整倍体形成的相关通路有关[12-16]。Li等[17]通过运用siRNA敲低MAD2L1获得非整倍体，MAD2L1(MAD2)是纺锤体组装检查位点(SAC)的成分，SAC具有促使减数分裂过程中同源染色体或有丝分裂中姐妹染色单体间张力的形成[18]。如果SAC在有丝分裂过程中出现异常，则会导致染色体的错误分离，形成非整倍体。既往研究中尚未有人采用盐酸强力霉素诱导非整倍体，据相关报道表明，盐酸强力霉素可能具有诱导非整倍体的作用，本研究就这一问题进行尝试，证实盐酸强力霉素可以诱导非整倍体。我们就盐酸强力霉素诱导非整倍体的机制进行研究发现，在撤药后第3天，非整倍体细胞MAD2L1表达完全消失，表明盐酸强力霉素能够破坏SAC的成分MAD2L1，导致染色体的错误分离，继而形成非整倍体，而随着撤药时间的增加，细胞MAD2L1逐渐恢复正常，表明不健康的非整倍体细胞大量死亡，而存活下来的非整倍体则可以继续生长及增殖。与既往通过shRNA敲除相关基因或采用siRNA敲低MAD2等方法相比，采用药物诱导非整倍体的方法操作简便，价格便宜，为之后非整倍体的获得提供了一个简单易行的方法。

端粒酶由hTERT、端粒酶RNA组分、端粒酶相关蛋白组成，是一种核糖蛋白复合物，能以自身RNA为模板，合成端粒重复序列，将端粒DNA送至真核细胞染色体末端，使端粒延长。hTERT在端粒酶的激活过程中起关键作用，端粒酶活性的表达与其密切相关[19]。研究表明，部分肿瘤细胞由于端粒酶的作用，能无限增殖，从而成为永生化细胞。Zhang等[20]通过在羊胚胎成纤维细胞中导入hTERT基因，可以使羊胚胎成纤维细胞获得无限增殖，从而成为永生化细胞。Meena等[3]研究发现，端粒酶可以拯救非整倍体诱导的端粒DNA的损伤、p53的激活、细胞早衰和耗竭。而关于整倍体与非整倍体之间端粒酶活性及hTERT基因表达的差异及作用，尚未有人进行相关研究，本研究发现非整倍体的端粒酶活性及hTERT基因表达明显高于整倍体。本研究分别在第6、8、11天检测hTERT基因及端粒酶活性，发现非整倍体hTERT基因及端粒酶活性表达逐渐升高，表明非整倍体的形成是一个不断变化及进化的过程，在撤药初期，不健康的非整倍体大量死亡，一部分非整倍体逃脱P53介导的凋亡作用，催化自身功能的不断进化，某些细胞产生促进肿瘤形成的核型，从而发挥促肿瘤形成作用。

AZT是应用最广的一种端粒酶抑制剂，能阻断端粒复制模板与单核苷酸之间的结合，使肿瘤细胞维持端粒长度的机制遭到破坏，从而导致端粒随着自身染色体复制而逐渐缩短，最终促进肿瘤细胞发生衰老凋亡[21-26]。研究表明，AZT可以对多种肿瘤细胞的端粒酶活性产生抑制作用，干扰细胞的正常生长及增殖[27-30]。本研究两组细胞加入AZT后，hTERT基因表达及端粒酶活性均出现不同程度下降，表明AZT可以下调hTERT基因表达及端粒酶活性，非整倍体组细胞下降程度较整倍体明显，表明非整倍体对AZT更敏感。

综上所述，盐酸强力霉素可以通过破坏纺锤体组装检查位点(SAC)的成分MAD2L1来诱导非整倍体形成，非整倍体细胞的端粒酶活性及hTERT基因表达高于整倍体，加入AZT后，整倍体细胞和非整倍体细胞hTERT基因表达及端粒酶活性均出现不同程度下降，非整倍体下降程度较整倍体明显，非整倍体对AZT更敏感。而关于AZT对整倍体及非整倍体细胞功能的影响及其机制尚有待进一步研究。

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