RGD对骨肉瘤细胞MG63的抑瘤作用

李杰等

【摘 要】目的：利用合成的RGD（ Arg-Gly-Asp） 三肽研究其对骨肉瘤细胞增殖抑制作用可能的机制。方法：不同浓度RGD作用于骨肉瘤细胞后，MTT法检测骨肉瘤细胞增殖抑制率变化，流式细胞术检测骨肉瘤细胞凋亡情况。结果：RGD能明显呈浓度依赖性抑制骨肉瘤细胞的生长。RGD处理后，可以导致MG63骨肉瘤细胞的凋亡。结论：RGD能明显抑制MG63骨肉瘤细胞生长，并促骨肉瘤细胞凋亡，这种作用具有明显时间剂量效应。

【关键词】RGD； 骨肉瘤； 凋亡；

骨肉瘤是一种临床常见恶性骨肿瘤，约占所有骨肿瘤的20%。其恶性程度高，好发于青少年，易复发和转移，预后较差[1]。目前临床上主要采用外科手术和化疗联合治疗，新辅助化疗的应用使骨肉瘤患者的生存率较以前有了很大的提高[2]。传统的化疗药物主要是通过细胞毒性药物杀灭肿瘤，其对机体严重的毒副作用和肿瘤产生的耐药性使继续有效的化疗陷入了困境。这都成为了目前困扰骨肉瘤治疗的主要问题。因此，寻找作用机制与现有化疗药物不同，且特异性高、毒副作用小的抗肿瘤靶向药物成为了肿瘤基础和临床的研究热点。RGD 肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp） 序列的短肽，广泛存在于生物体内，是整合素（ Integrin） 与其配体蛋白相互作用的识别位点。自Pierschbacher 等于1984年首次报道纤维蛋白原中所含的RGD 序列为细胞识别位点以来，RGD 肽及其衍生物就成为众多学者关注与研究的热点。通过本实验我们发现，RGD可以抑制骨肉瘤细胞增殖并促进骨肉瘤细胞凋亡作用。

1 材料及方法

1.1 试剂 RGD 三肽及人骨肉瘤细胞MG63由本实验室保存。细胞培养用DMEM 培养基含10%胎牛血清和1%的青、链霉素，购自杭州四季青生物工程材料有限公司，无噬菌体，低内毒素，培养条件为5%的CO2及37 ℃。MTT及凋亡试剂盒均购自Sigma公司。

1.3 细胞传代及培养 骨肉瘤细胞在5%CO2和37℃的条件下，在含10%～15%小牛血清的1640培养基（ Invitrogen）中贴壁生长。细胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化进行传代。加入0.5～1ml 0.25%胰酶溶液，一般室温消化时间约为1～3分钟。用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

1.3 实验分组 本实验共分为4组，RGD 25μg/ml组，RGD 50μg/ml组，RGD 75μg/ml组及空白对照组。

1.4 MTT检测细胞增殖 将处于对数生长期的骨肉瘤细胞于转染后的第24h、48h加入MTT20μl/孔（5mg/ml），继续培养4h后吸弃上清。加入二甲亚砜150μl/孔，溶解甲瓒紫结晶，酶标仪570nm波长下测定吸光度A值，每孔设3个复孔取均值，计算抑制率。相对抑制率=（1-转染组/ 对照组）×100﹪。

1.5 细胞凋亡实验 取对数生长期细胞胰酶消化、细胞计数，以5*105/瓶细胞数转至6孔板培养16h，加无血清培养基同步化12h，进行加药处理。分别给药作用24h和48h后，胰酶消化，离心收集细胞，用冷PBS 洗涤两次，加入100μL 1X annexin-binding buffer溶解，按照凋亡检测试剂盒操作依次加入检测试剂 。流式检测细胞凋亡 。

1.6 统计学分析 采用SPSS 121 0 软件包处理数据， 采用单因素方差分析， 以P< 0.05 为差异具有统计学意义， 实验数据均重复测定3 次以上。

2 实验结果

2.1 MTT结果呈现浓度依赖性抑制MG63骨肉瘤细胞增殖，RGD 对MG63 细胞的增殖抑制如表1所示。结果显示，RGD 能明显抑制MG63 细胞增殖，并且这种抑制作用呈浓度依赖性增强。

2.2 RGD诱导MG63 骨肉瘤细胞凋亡：RGD诱导MG63 细胞凋亡结果如图1，图2所示。流式细胞检测显示，RGD能明显促进MG63细胞凋亡，并且这种凋亡作用呈浓度依赖性增强。

3 讨论

RGD 肽作为整合素和其配体相互作用的识别位点，能与肿瘤细胞或者新生血管特异表达的某些整合素如αvβ3结合[3]， 众所周知，肿瘤血管的生成或新生血管的萌芽在肿瘤的生长和转移中起到重要作用。研究表明，没有形成新生血管来提供氧气和营养物质的，肿瘤的生长不会增长。而一旦血管化，以前处于休眠状态的肿瘤便开始迅速增长，侵入周围组织，并发生远处转移。既然癌细胞能够高效的侵袭和转移，那么之前细胞外基质的降解则是其入侵前必需的。整合素作为一类细胞黏附受体分子，则广泛参与细胞与细胞外基质、细胞与细胞之间的相互作用[4]。虽然内皮细胞能够表达许多种不同的整合素，但是αvβ3 在血管生成中是最重要的[5]。在激活的内皮细胞、新生血管以及某些肿瘤细胞常特异性地高表达整合素αvβ3，而在处于休眠状态的内皮细胞和正常的器官系统则不表达，使肿瘤血管靶向治疗成为可能[6]。 研究表明整合素αvβ3 在骨肉瘤实体肿瘤细胞表面有高水平的表达，而在正常骨细胞未见表达，在其他实体肿瘤表面少量表达[7]。而且骨肉瘤易通过血管肺部转移，Ham等人[8]利用RGD与整合素αvβ3结合研究表明携带RGD的相关病毒静脉用药骨肉瘤肺转移的小鼠，结果提示，通过RGD的介入明显抑制了骨肉瘤肺部转移瘤的生长，认为RGD在骨肉瘤血管靶向治疗上发挥重要作用。相信RGD肽修饰后的相关给药系统以及病毒载体在高表达整合素αvβ3骨肉瘤治疗上以及抑制骨肉瘤肺转移上应该有很好的应用前景。

在本实验中，通过MTT检测我们观察到各实验组对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用均明显高于对照组，且随时间推移，抑制率增加。通过细胞凋亡实验检测，各实验组对骨肉瘤细胞的凋亡作用均明显高于对照组，且随时间推移，凋亡率增加。结果显示，RGD可以抑制骨肉瘤细胞增殖并促进骨肉瘤细胞凋亡作用。

参考文献：

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