右美托咪定混合氯胺酮对新生大鼠离体海马细胞凋亡的影响

吴新海+赵中保+莫丽贤

【摘要】 目的 探讨右美托咪定（Dex）混合氯胺酮对新生大鼠离体海马细胞凋亡的影响。方法 SD新生大鼠（出生7 d）海马神经元体外培养6 d， 采用随机数字表法分为对照组（C组）， 100 μmol/L氯胺酮组（K组）， 10 μg/ml Dex组（D组）， 10 μg/ml Dex 混合100 μmol/L氯胺酮组（DK组）， 各6只。孵育24 h后采用免疫组化法检测Caspase-3蛋白的表达， 双染法检测神经元凋亡。结果 与C组比较， K组的海马细胞凋亡率和Caspase-3表达水平升高（P<0.05）；与C组比较， D组海马细胞凋亡率和Caspase-3表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与K组比较， DK组和D组的海马细胞凋亡率和Caspase-3表达水平降低（P<0.05）。结论 Dex能减轻氯胺酮诱导的新生大鼠离体海马细胞凋亡。

【关键词】 右美托咪定；氯胺酮；海马细胞；凋亡

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.14.210

Influence by dexmedetomidine mixed with ketamine on isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats WU Xin-hai， ZHAO Zhong-bao， MO Li-xian. Department of Anesthesiology， Beijing University Shenzhen Hospital， Shenzhen 518036， China

【Abstract】 Objective To investigate influence by dexmedetomidine （Dex） mixed with ketamine on isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats. Methods Hippocampal neuron from SD infant rats （7 d after birth） were taken for 6-d culture in vitro， and they were randomly divided into control group （group C）， 100 μmol/L ketamine group （group K）， 10 μg/ml Dex group （group D）， and 10 μg/ml Dex mixed with 100 μmol/L ketamine group （group DK）， with 6 rats in each group. After 24 h of incubation， immunohistochemistry method was applied to detect expression of Caspase-3 protein， and double-staining method was used to detect neuronal apoptosis. Results Comparing with group C， group K and increased hippocampus cells apoptosis rate and Caspase-3 expression level （P<0.05）， and group D had no statistically significant difference of hippocampus cells apoptosis rate and Caspase-3 expression level （P>0.05）. Comparing with group K， groups KD and D had reduced hippocampus cells apoptosis rates and Caspase-3 expression levels （P<0.05）. Conclusion Dex can relieve ketamine-induced isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats.

【Key words】 Dexmedetomidine； Ketamine； Hippocampus cells； Apoptosis

氯胺酮可改变发育中大鼠海马神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA）的表达及谷氨酸的活化， 诱导海马细胞变性和远期认知功能的障碍[1， 2]。高选择性的α2 受体激动剂Dex是高选择性α2肾上腺素受体， 作用于中枢神经与周围神经系统及其他器官组织的α2肾上腺素受体， 动物实验证实Dex具有神经保护作用， 能减轻异氟烷导致的新生大鼠海马细胞凋亡[3， 4]；而Dex与氯胺酮合用对新生大鼠海马细胞凋亡的影响尚不清楚。现将本院研究结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 实验材料：清洁级出生7 d的雄性SD大鼠（北京大学深圳医院实验动物中心提供）， 体重10～16 g。盐酸氯胺酮（上海制药一厂）， Dex（江苏恒瑞医药股份有限公司）， DMEM/F-12（Sigma）， B27（Gibi-co）， 胎牛血清（杭州四季青）， Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）， Caspase-3免疫组化试剂盒（江苏海门碧云天技术研究所）， 激活型caspase-3单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）， β-actin单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。实验用仪器：CO2恒温细胞培养箱， 流式细胞仪（BD公司）， 倒置相差显微镜（日本Olympus）， 高速低温离心机。

1. 2 方法

1. 2. 1 海马神经元培养 取新生7 d内的SD大鼠在无菌环境中， 剪开皮肤和颅骨， 取脑组织置预冷D-Hank S液的培养皿中， 在显微镜下取海马。将海马移至另一预冷HBSS液的培养皿中剪碎， 将海马移至另一预冷HBSS液的培养皿中剪碎， 加入胰蛋白酶， 加入等量HBSS液， 置37℃ 、5% CO2 培养箱消化15 min。用含10% 胎牛血清的DMEM/F12终止反应， 吹散为单细胞悬液， 静置后取上清液， 约1000 r/min离心5 min， 弃上清细胞计数后， 用含2% B27、EGF、bFGF培养基稀释使细胞数为5×105个/ml， 以100 μl接种于96孔培养板中， 37℃ 、5%CO2 培养箱中培养， 24 h后全量换液， 48 h后加入终浓度为10 μmol/L阿糖胞苷作用24 h更换新培养液， 以后每2天半量换液， 培养6 d用于实验。

1. 2. 2 实验分组 将对数生长期的新生大鼠海马神经元随机分为对照组（C组）；100 μmol/L氯胺酮组（K组）；10 μg/ml Dex组（D组）；10 μg/ml Dex 混合100 μmol/L氯胺酮组（DK组）。每组设6个平行样。将各组细胞置于37℃、5% CO2 培养箱培养24 h。

1. 2. 3 海马细胞凋亡率的流式细胞仪检测 培养的海马细胞收集到10 ml的离心管中， 每样本细胞数为5×106， 1000 r/min离心5 min弃培养液。PBS洗1次， 1000 r/min离心5 min。用5 μl的Annexin V重悬细胞， 室温下避光孵育15 min， 1000 r/min离心5 min沉淀细胞， PBS液洗1次， 加入5 μl的PI 4℃下孵育20 min， 避光并不时震荡。上流式细胞仪检测海马细胞凋亡率。

1. 2. 4 海马细胞caspase-3阳性表达的检测 6孔培养板中的细胞接种于盖玻片， 免疫细胞化学染色法固定， 参照说明书操作， 细胞核着深褐色即为阳性细胞， 光镜下随机取5个视野， 计算平均阳性细胞数反映caspase-3蛋白的表达水平。

1. 3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

与C组比较， K组的海马细胞凋亡率和caspase-3蛋白表达水平升高（P<0.05）；与C组比较， D组海马细胞凋亡率和caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与K组比较， DK组和D组的海马细胞凋亡率和caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。见表1。

3 讨论

NMDA受体参与中枢神经系统发育过程的调控， 调节兴奋性突触传递和发育过程中突触可塑性， 与神经元生长、分化、迁移和功能修饰密切相关， 并参与学习记忆的形成[5， 6]。NMDA受体拮抗剂氯胺酮， 可以阻断神经递质谷氨酸和NMDA受体的结合， 动物实验证实大量使用氯胺酮可导致新生大鼠神经系统发育和功能的异常[7]。实验证实， 氯胺酮可使体外培养的新生大鼠海马细胞的凋亡率增加以及caspase-3蛋白表达增加；caspase-3是所有细胞凋亡途径的最后效应子， 哺乳动物神经元的凋亡可高表达caspase-3 ， 因此检测caspase-3的表达可反映神经元凋亡程度。

Dex作用于中枢神经与周围神经系统及其他器官组织的α2肾上腺素受体， 具有镇静、镇痛、抑制交感神经活性的效应， 常用作临床麻醉辅助用药[1， 2]。动物实验证实Dex具有神经保护作用， 不仅能减轻缺血性大鼠脑细胞损伤[3]， 还能减轻异氟烷导致的新生大鼠海马细胞凋亡[4]。前期研究也发现Dex证实减轻七氟烷诱导的新生大鼠远期认知功能的障碍[8]。在本研究中， 发现Dex不影响新生大鼠离体培养的海马细胞的凋亡， 但是混合氯胺酮能减轻其诱导的新生大鼠离体海马细胞的凋亡。Dex对于吸入麻醉剂和氯胺酮诱发的发育中大鼠脑细胞损伤的保护作用的机制尚不清楚， 有研究认为Dex神经保护机制可能通过降低循环中及脑细胞外的儿茶酚胺浓度、抑制钙离子内流和兴奋性氨基酸的释放、激活Akt或ERK等细胞生存信号通道， 调节凋亡和抗凋亡蛋白之间的平衡[9]。

参考文献

[1]Sinner B， Friedrich O， Lindner R， et al. Long-term NMDA receptor inhibition affects NMDA receptor expression and alters glutamatergic activity in developing rat hippocampal neurons. Toxicology， 2015， 333：147-155.

[2]Yan J， Huang Y， Lu Y， et al. Repeated administration of ketamine can induce hippocampal neurodegeneration and long-termcognitive impairment via the ROS/HIF-1α pathway in developing rats. Cell Physiol Biochem， 2014， 33（6）：1715-1732.

[3]Hoffman WE， Kochs E， Werner C， et al. Dexmedetomidine improves neurologic outcome from incomplete ischemia in the rat. Reversal by the alpha 2-adrenergic antagonist atipamezole. Anesthesiology， 1991， 75（2）：328-332.

[4]Sanders RD， Xu J， Shu Y， et al. Dexmedetomidine attenuates isoflurane-induced neurocognitive impairment in neonatal rats. Anesthesiology， 2009， 110（5）：1077-1085.

[5]Fredriksson A， Archer T， Alm H， et al. Neurofunctional deficits and potentiated apoptosis by neonatal NMDA antagonist administration. Behav Brain Res， 2004， 153（2）：367-376.

[6]Behar TN， Scott CA， Greene CL， et al. Glutamate acting at NMDA receptors stimulates embryonic cortical neuronal migration. J Neurosci， 1999， 19（11）：4449-4461.

[7]Green CR， Kobus SM， Ji Y， et al. Chronic prenatal ethanol exposure increases apoptosis in the hippocampus of the term fetal guinea pig. Neurotoxicol Teratol， 2005， 27（6）：871-881.

[8]吴新海， 邓若熹， 张燕. 右美托咪定减轻七氟醚诱导的新生大鼠海马细胞凋亡和远期认知障碍. 国际麻醉学与复苏杂志， 2015， 36（9）：782-786.

[9]Zhu YM， Wang CC， Chen L， et al. Both PI3K/Akt and ERK1/2 pathways participate in the protection by dexmedetomidine against transient focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Brain Res， 2013， 1494（4）：1-8.

[收稿日期：2016-01-21]