β－catenin和WISP－1在糖尿病大鼠心肌中的表达

汪华学 陶 静 叶红伟 冯振中 高 琴＊

（1蚌埠医学院第一附属医院重症监护中心，安徽233004；2蚌埠医学院生理学教研室，3病理学教研室，安徽233030）

糖尿病是严重危害人类生活质量的重大疾病之一。随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。糖尿病患者心血管疾病的发生率较高，在有与糖尿病相关的死亡中，80%左右与心血管疾病有关。糖尿病引起的心血管疾病发病机制非常复杂，涉及代谢紊乱、胰岛素抵抗、心肌细胞增生、肥大、心肌间质胶原沉积及纤维化、细胞凋亡等多种机制。

Wnt信号途径是由Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等组成的复杂的信号通路，参与胚胎的生长和形态发育、能量代谢的平衡、干细胞的维持等多种生物学过程的调控，其中对 Wnt／β－catenin通路的研究最为深入。β－catenin是经典 Wnt通路中关键的胞内效应分子，它进入细胞核后通过与LEF／TCF家族的转录因子结合调控特定基因的表达［1］。Wnt信号通路除了参与正常的生理过程外，还参与肿瘤的形成、创伤修复、糖尿病的发生、心肌梗死等病理变化［2－3］。

Wnt诱 导 分 泌 蛋 白－1（Wnt－induced secreted protein－1，WISP－1）是 Wnt信号通路活化后的下游靶基因之一［4］。最近研究表明，WISP－1参与器官损伤修复，肺、心、肝等脏器纤维化的发生。糖尿病诱导的心肌损伤是否与 Wnt／β－catenin信号通路及下游WISP－1有关，报道较少。实验通过观察 Wnt／β－catenin信 号 通 路 中 β－catenin 和 下 游 靶 基 因WISP－1在糖尿病心肌中的表达，分析该途径在糖尿病心肌损伤中的作用。

材料和方法

1．材料

1．1药品和试剂

链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美国Sigma公司），血糖测定仪（台欣生物科技研发股份有限公司），羟脯氨酸（hydroxyproline，Hp）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。β－catenin和 WISP－1抗体购置美国Santa Cruz公司。

1．2实验动物

健康雄性Sprague－Dawley大鼠，体重（200±20）g，清洁级，由蚌埠医学院实验动物中心提供。

2．方法

2．1实验分组和动物模型制备

大鼠适应性喂养1w后随机分为正常对照组（Control Group）和糖尿病组（DM Group）。DM 组大鼠空腹12h后腹腔注射STZ 55mg／kg（0．1mol·L－1，pH＝4．4的枸橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg·ml－1的 STZ 溶液），72h后测空腹血糖≥16．7mmol／L为造模成功。大鼠充足饲料，自由饮水。实验持续8w。

2．2空腹血糖监测

各组大鼠喂养至8w，尾静脉取血测定空腹血糖水平。

2．3心体比测定

至8w末称取大鼠体重。大鼠处死后，称取心脏重量，计算心脏重量与大鼠体重之比，即心体比。

2．4心肌组织羟脯氨酸含量测定

至8w末，动物处死后取左室心肌组织约100mg于－80℃冰箱保存，按照试剂盒说明书依次操作测定Hp含量。

2．5电镜观察心肌超微结构变化

取心肌组织切成1mm3组织块，立刻置于3%戊二醛。10g／l锇酸固定，梯度乙醇脱水包埋后，超薄切片，电子染色，日产JEM－1230型透射电镜观察心肌超微结构改变。

2．6免疫组化测定心肌β－catenin和 WISP－1蛋白表达

甲醛固定心尖部心肌组织，常规石蜡包埋，连续切片。免疫组织化学染色（SP法）观察心肌组织βcatenin和WISP－1蛋白表达，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。显微镜下判断胞浆内无棕黄色反应物或仅有极少棕黄色颗粒为阴性（－）；细胞浆内出现浅棕色为弱阳性（＋）；中等棕黄色为中等阳性（＋＋）；深棕黄色为较强阳性（＋＋＋）；棕褐为强阳性（＋＋＋＋）［5］。采用 HPLAS－2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对蛋白进行分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野，测定每个视野阳性面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应总面积／单位面积中细胞总面积×100%）。

3．统计学分析

实验数据以¯x±s表示，两两比较采用t检验。

结 果

1．大鼠空腹血糖和心体比

与正常对照组相比，糖尿病组大鼠空腹血糖水平明显上升，心体比增加（表1），提示糖尿病引起心肌肥大。

2．大鼠心肌羟脯氨酸含量

与正常对照组相比，糖尿病组大鼠心肌羟脯氨酸含量明显增加（表1），提示糖尿病可诱导心肌纤维化的发生。

3．心肌超微结构改变

电镜观察心肌超微结构变化，对照组大鼠心肌细胞肌原纤维排列整齐、规则，线粒体膜完整，无肿胀。糖尿病组心肌肌原纤维排列模糊，可见肌小节断裂；线粒体肿胀、部分膜破损，有空泡形成（图1）。

表1 血浆空腹血糖水平、心体比和心肌羟脯氨酸含量化（±s）Table 1 Plasma fasting blood glucose（FBG）level，heart weight／body weight（H／W）and cardiac hydroxyproline（Hp）content（±s，n＝8）

表1 血浆空腹血糖水平、心体比和心肌羟脯氨酸含量化（±s）Table 1 Plasma fasting blood glucose（FBG）level，heart weight／body weight（H／W）and cardiac hydroxyproline（Hp）content（±s，n＝8）

＊＊P＜0．01compared with Control group

Group FBG（mmol／L） H／W （mg／g） Hp（umol／mg）Control Group 8．49±2．13 3．47±0．07 0．28±0．06 DM Group 32．48±3．20＊＊ 4．48±0．11＊＊ 0．43±0．04＊＊

4．大鼠心肌β－catenin和 WISP－1蛋白表达

免疫组化蛋白表达结果显示正常对照组心肌细胞胞浆和细胞连接处可见少量散在分布的棕黄色颗粒，β－catenin蛋白表达成（＋）；DM组心肌细胞胞浆和细胞连接处可见广泛密集呈弥散分布的棕黄色颗粒，阳性表达增强，达（＋＋＋）（图2，表2）；DM 组心肌β－catenin蛋白表达阳性面积率明显高于正常对照组（P＜0．01）。WISP－1阳性表达定位于胞浆，正常对照组心肌细胞胞浆极少棕黄色颗粒，蛋白表达呈（－）；DM组心肌细胞胞浆可见广泛密集呈弥散分布的棕黄色颗粒，表达呈（＋＋＋）（图3，表2）；DM组心肌WISP－1蛋白表达阳性面积率明显高于正常对照组（P＜0．01）。

图1 正常大鼠心肌超微结构1A）和糖尿病大鼠（1B）心肌超微结构（×10K）。图2 β－catenin在正常大鼠心肌（2A）和糖尿病大鼠心肌（2B）中的表达（SP×400）。图3 WISP－1在正常大鼠心肌（2A）和糖尿病大鼠心肌（2B）中的表达（SP×400）。Fig．1Myocardium ultrastructure in control rat（1A）and diabetic rat（1B）（×10K）Fig．2Expression of myocardialβ－catenin in control rat（2A）and diabetic rat（2B）（SP×400）Fig．3Expression of myocardial WISP－1in control rat（3A）and diabetic rat（3B）（SP×400）

表2 β－catenin和 WISP－1在大鼠心肌组织的表达（¯x±s，n＝8）Table 2 Expressions ofβ－catenin and WISP－1 proteins in myocardium tissues（¯x±s，n＝8）

讨 论

实验结果显示，与正常对照组相比，糖尿病大鼠空腹血糖明显增高，心体比增加，心肌羟脯氨酸含量增加，心肌超微结构显示肌纤维断裂，线粒体损伤，心肌β－catenin和 WISP－1表达增加，提示 Wnt／βcatenin信号通路在糖尿病诱导的心肌损伤中被激活，可能与糖尿病诱导的心肌肥大、心肌纤维化的发生有关。

β－catenin是Wnt信号转导通路的下游元件。Wnt信号途径是否激活取决于细胞内游离β－catenin的水平［6］。正常情况下胞质内β－catenin受多种蛋白质的共同调控，胞质内游离β－catenin水平极低。当Wnt因子与其受体结合，Wnt信号传导使GSK3－β被抑制，β－catenin不能被正常水解而积累，过量的β－catenin进入细胞核与目的基因结合，促进细胞增殖。因此β－catenin水平的增高提示 Wnt信号通路的激活。Wnt／β－catenin信号通路在心肌损伤中的作用越来越引起重视。Hahn等研究表明，βcatenin过表达可刺激新生大鼠心肌成纤维细胞的增殖、分化，诱导心肌细胞肥大［7］。小鼠心肌梗死模型中，Wnt信号通路被激活［8］。急性心肌梗死时，损伤部位的心外膜和心肌成纤维细胞Wnt通路被激活［9］。以上结果显示 Wnt信号通路参与心肌损伤。糖尿病诱导心肌肥大、心肌纤维化的发生，Wnt信号通路是否参与糖尿病引起的心肌病变呢？实验中我们观察到糖尿病大鼠喂养至8w，随着心肌肥大和纤维化的发生（心体比的增高和心肌羟脯氨酸含量的增加），心肌β－catenin表达增高，提示 Wnt信号通路亦参与糖尿病诱导的心肌损伤。

WISP－1是一种富含半胱氨酸的分泌性蛋白多肽，可由成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、心肌细胞等多种细胞合成分泌，存在于多种组织器官。WISP－1作为β－catenin的下游靶基因之一，可促进细胞增殖、介导细胞黏附、促进细胞外基质合成、刺激细胞转移等，同时也调节较复杂的生物学过程，参与血管形成和肿瘤发生。WISP－1被认为是促进纤维化发生的主要细胞因子。Colston等报道WISP－1可促进原代培养的心肌细胞增殖，同时促进心肌成纤维细胞增殖和胶原合成［10］。心肌梗死后过度表达WISP－1及其受体黏合素，WISP－1可能通过黏合素分子信号通路触发下游反应，引起 WISP－1信号增强，导致心肌细胞肥大、成纤维细胞增生和心肌纤维化的发生。糖尿病心肌损伤与WISP－1的关系尚未见报道。本实验中我们观察到，随着糖尿病大鼠心肌β－catenin表达增高，WISP－1表达亦增加，我们推测糖尿病病程发展过程中，高糖通过激活Wnt／β－catenin信号通路引起下游 WISP－1表达增多，诱导糖尿病大鼠心肌肥大和心肌纤维化的发生，其具体机制还有待进一步研究。

［1］闫胜男，韩芳，石玉秀．大鼠PTSD后蓝斑核β－catenin的表达下降伴随细胞凋亡．中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（1）：1－4

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［5］崔芳芹，贾雪梅，汪渊等．高脂血症大鼠下颌下腺内AQP1和AQP5表达及意义．中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（1）：74－78

［6］Clevers H，Nusse R．Wnt／β－catenin signaling and disease．Cell，2012，149（6）：1192－1205

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［10］Colston JT，de la Rosa SD，Koehler M，et al．Wnt－induced secreted protein－1is a prohypertrophic and profibrotic growth factor．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293（3）：H1839－846