CD82／KAI1在膀胱尿路上皮癌中的表达

唐 甜 陕 光 陈小希

（1武汉大学人民医院肿瘤Ⅱ科，2武汉大学人民医院泌尿Ⅱ科，湖北430060；3湖北省地质职工医院，武汉430072）

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在膀胱癌中，90%以上是尿路上皮癌。超过70%的尿路上皮癌在治疗后复发，复发肿瘤中约30%出现恶性度增加。全球发病率呈逐渐上升趋势，全球每年约有35．6万新增病例，发病率位居所有肿瘤的第9位［1］。膀胱癌的浸润和转移与多种癌基因和抑癌基因的表达、调控以及细胞凋亡有关［2］，早期做出正确的诊断对疾病的治疗与预后有重要的临床意义。

肿瘤的形成和转移是多基因、多因子共同作用的结果。KAll／CD82基因是一种肿瘤转移抑制基因，KAll／CD82蛋白属于4次跨膜超家族（transmembrane4superfamily，TM4SF），通过调节细胞间的粘附，抑制肿瘤细胞脱离原发灶，而起到抑制肿瘤转移的作用［3，4］。

我们通过免疫组织化学方法试图探讨CD82／KAII与膀胱移行细胞癌的关系，以期能进一步阐明膀胱癌发生发展的机理，寻找早期预测膀胱癌发生发展的分子生物学标记物，为膀胱癌的发生和复发的预测提供一定的参考依据。

材料和方法

1．材料

收集武汉大学人民医院病理科2006－2010年膀胱尿路上皮癌存档蜡块50例（均经病理学证实为膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年龄50．3岁，另5例癌旁组织距瘤缘3－5cm。标本均经HE染色，光镜观察诊断，按 WHO尿路肿瘤组织学分类（2004），浸润性尿路上皮癌30例，非浸润性乳头状尿路上皮癌；高级别15例，低级别5例；按UICC临床分期，T1期31例，T2期11例，T3－4期8例。其中未经化疗的初发肿瘤28例，化疗后复发肿瘤22例。

2．方法

HE染色 常规取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

3．主要试剂

即用型兔抗人CD82／KAI1多克隆抗体；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中杉生物技术有限公司）。

4．免疫组织化学SP法检测CD82／KAI1相关抗原

具体步骤：5μm 组织切片常规脱蜡至水后，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×3min；抗原修复，室温自然冷却后，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗5×3min；滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×5min；滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×3 min；滴加链霉素抗生物素蛋白－过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×3min；滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间（约3－5min），自来水冲洗终止反应；苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0．1%氨水返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为CD82／KAI1的阳性对照组。

5．免疫组织化学结果判断

5．1CD82／KAI1以胞膜或胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

5．2采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对CD82／KAI1的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

6．统计学处理

统计学处理 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q检验，检验水准α为0．05。

结 果

CD82∕KAI1的表达

膀胱尿路上皮癌细胞内可见少量的棕黄色颗粒，CD82／KAI1呈阴性表达（图1）；癌旁组织细胞内可见较多棕黄色颗粒，CD82／KAI1呈阳性表达（图2）。图像分析结果见表。经q检验，膀胱尿路上皮癌与癌旁组织之间，CD82／KAI1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0．05）（表1）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织CD82／KAI1表达的平均光密度和阳性面积率±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of CD82／KAI1 in Bladder Urothelial Cancer and Para－cancertissue（¯x±s）

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织CD82／KAI1表达的平均光密度和阳性面积率±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of CD82／KAI1 in Bladder Urothelial Cancer and Para－cancertissue（¯x±s）

＊ 膀胱移行细胞癌与癌旁组织比较（comparison between Bladder Urothelial Cancer andPara－cancertissue），P＜0．05

组别Group例数n平均光密度Average optical densit阳性面积率Rate of positive area膀胱尿路上皮癌 50 0．0591±0．0021 0．0562±0．0020 Bladder Urothelial Cancer癌旁组织 5 0．2874±0．0074 0．2720±0．0066 Para－cancer tissue

图1 KAl1／CD82的表达：膀胱尿路上皮癌组 胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，KAl1／CD82呈阴性表达（→）。HE×200图2 KAl1／CD82的表达：癌旁组织 细胞核和胞浆内可见较多棕黄色颗粒，KAl1／CD82呈阳性表达（→）。HE×200Fig．1The expression of KAl1／CD82：bladder urothelialcancer group：There were few brown particles in thenucleus or cytoplasm，which showed KAl1／CD82expressed negative．HE×200Fig．2The expression of KAl1／CD82：cancer side tissue：There were plenty of brown particles in thenucleus or cytoplasm，which showedKAl1／CD82expressed positive．HE×200

讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，目前发病率呈上升趋势，且复发率高，易产生获得性耐药。膀胱癌初发时80%为浅表性，其中70%术后复发，复发者30%向高级高期发展，15%－30%的患者初发时即具有侵袭性，即使经过治疗，也较早转移。因此，研究与膀胱癌发生发展的分子生物学机理，寻找早期预测膀胱癌发生发展的分子生物学标记物，为膀胱癌的发生和复发的预测提供一定的参考依据具有重要的临床意义。

人类CD82／KAl1基因是一种肿瘤转移抑制基因，定位于染色体1lpl12上，CD82／KAl1cDNA长2．4kb，编码含有267个氨基酸的蛋白质，其分子量为29．61kD。CD82／KAl1蛋白属于4次跨膜超家族（TM4SF），主要存在于白细胞和其它组织细胞表面［5－8］，膜内则有较短的氨基和羧基尾巴。CD82／KAl1基因通过调节细胞间的粘附，抑制肿瘤细胞脱离原发灶，而起到抑制肿瘤转移的作用。CD82／KAl1在机体大多数组织中表达，分布广泛，如前列腺、肝、肺、脾、骨髓、胎盘等组织表达丰富，乳腺、胰腺、骨 骼 肌、胸 腺 等 也 可 见［9－12］。 目 前，尽 管 对CD82／KAl1蛋白的生物学功能仍不完全清楚，但其在上皮细胞膜上的定位和广泛的糖基化提示，CD82／KAl1蛋白参与细胞间、细胞与胞外基质间的反应，这两种反应在肿瘤的侵袭和转移中起相当重要的作用［13－15］。近年来的研究证实 CD82／KAl1基因表达下降或缺失与人类胰腺癌、胃癌及食管癌、前列腺癌的转移和预后密切相关；随着肿瘤转移灶的形成与发展，其表达逐渐下降或缺失，表明CD82／KAl1基因可以抑制肿瘤转移。

我们采用免疫组织化学的方法，对膀胱尿路上皮癌组织中CD82／KAI1的表达进行检测，旨在探讨它们与膀胱尿路上皮癌发生发展的关系。结果表明：CD82／KAI1在膀胱尿路上皮癌中呈低表达，癌旁组织中呈高表达。原因可能为：CD82／KAI1基因高表达是肿瘤发生发展中常见的早期分子事件，CD82／KAI1基因在恶性程度高的膀胱尿路上皮癌中低表达而失去了其作为肿瘤转移抑制的作用，导致癌细胞的浸润转移。CD82／KAI1基因的异常表达可能肿瘤发生有关 这可能对肿瘤的早期诊断有帮助，也可将CD82／KAI1蛋白表达水平可作为评估膀胱尿路上皮癌的转移潜能、间接判断预后的一个指标。

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