小G蛋白Rac1在马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用及意义

胡丽萍，陆红，白永恒，王斯璐，洪炜龙，林成成，梁勇，林向阳

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325000，1.医学检验中心；2.外科实验室）

近年来，有关服用中草药导致的肾脏损害屡见报道，马兜铃酸（aristolochic acid，AA）就是其中之一。在体内，AA引起损伤的主要病理表现为炎症细胞浸润、肾小管上皮细胞凋亡和坏死以及间质纤维化等[1]。目前AA致肾间质纤维化的分子机制尚不明确。我们前期研究显示，TGF-β1可能在AA诱导肾间质纤维化中发挥重要作用[2-3]。最近研究显示，GTPase Rho家族某些成员在调控TGF-β1中具有重要作用[4]。本研究拟通过体外实验观察AA对肾小管上皮细胞的损伤作用，同时探究GTPase Rho的重要成员Rac1蛋白在AA损伤小管上皮细胞过程中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 AA（美国Sigma公司）；DMEM细胞培养液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶和TRIzol提取液（美国Gibco公司）；WST-1和Hoechst 33258染色液（上海碧云天公司）；兔抗鼠Rac1抗体（美国Santa Cruz公司）；兔抗鼠III型胶原抗体（Bioworld公司）；Rac1和TGF-β1 ELISA检测试剂盒（上海西唐生物）；RT-PCR试剂（美国Promega公司）；MYCYCLER梯度PCR仪（美国BIOROD公司）；7500定量PCR仪（美国Applied Biosystens公司）；Varioskan Flash全波长多功能扫描仪（美国Thermo Scientific公司）；DM4000 B LED荧光正置显微镜（德国Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。NRK-52E细胞在含5%小牛血清的DMEM培养液中，于37 ℃，5% CO2培养箱内培养。取细胞接种于6孔板中，待细胞70%～80%融合时，在培养液中加入AA，对照组加入含有等量溶剂的培养液。继续培养24 h后，用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。

1.2.2 WST-1法检测细胞增殖抑制率：取对数生长期的NRK-52E细胞，用胰酶消化，调整细胞密度为5×107/L，接种于96孔培养板中，每孔加入100μL培养液。待细胞贴壁后，实验组每孔加入浓度为5、10、20、50和100μg/mL的AA，并设6个平行孔，作用24 h，对照组加溶剂；另外，在保持AA作用浓度为10μg/mL的情况下，分别作用24、48和72 h。培养结束前2 h每孔加入10μL WST-1溶液，培养结束后于全波长多功能扫描仪上测量450 nm主波长和690 nm副波长的吸光度值（A值），实验重复3次。按公式计算AA对NRK-52E细胞增殖的抑制率：细胞增殖抑制率（%）=1-（实验组A450值－空白组A690值）/（对照组A450值－空白组A690值）×100%。

1.2.3 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡：将预处理的洁净盖玻片置于6孔板内，接种细胞培养过夜，当细胞密度达到70%～80%时，分别加入AA药物1μg/mL和10μg/mL作用24 h，移去培养液，4%多聚甲醛固定10 min，弃固定液，PBS洗两次，Hoechst 33258染液染色5 min，去染色液，PBS洗两次，吸尽液体。滴加抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，荧光显微镜观察，并随机选取位置拍照。

1.2.4 real-time RT-PCR检测TGF-β1 mRNA的表达：采用Trizol试剂提取已处理细胞中的RNA，于260/280 nm测定吸光度值以确定样本纯度和浓度。根据试剂说明书将RNA反转录成cDNA。应用Primer 5.0软件设计TGF-β1 mRNA的特异性引物，以β-actin作为内参，引物由上海生工公司合成。引物序列为TGF-β1：5’-AGGCGGTGCTCGCTTTGT-3’（正向）和5’-GATTGCGTTGTTGCGGTCC-3’（反向）；β-actin：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’（正向）和5’-TTTAATGT CACGCACGATTTC-3’（反向）。PCR扩增体系：5μL 2×SYBR Green荧光定量试剂、2μL引物（上、下游各1μL，终浓度200 nmol/L）、2μL反应缓冲液、1 μL cDNA。PCR程序为：95 ℃ 3 min预变性，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40个循环。采用相对定量法计算获得结果，溶解曲线分析结果的可靠性。相对表达量=2－△△Ct，ΔΔCt=［Ct目的基因（待测样品）-Ct内参照（待测样品）］－［Ct目的基因（校正样品）－Ct内参照（校正样品）］。

1.2.5 ELISA法检测Rac1和TGF-β1蛋白含量：取对数生长期的NRK-52E细胞，分别以1、5、10μg/mL AA作用24 h，收集培养液。Rac1和TGF-β1含量检测采用双抗体夹心ABC-ELISA法，严格按照Rac1和TGF-β1 ELISA检测试剂盒说明书进行操作。采用BCA法进行蛋白定量，根据与总蛋白比值绘制标准曲线。

1.2.6 细胞免疫荧光检测III型胶原和Rac1含量：将预处理的洁净盖玻片置于6孔板内，接种细胞培养，待细胞贴壁后，加入AA药物10μg/mL作用24 h。轻轻取出细胞爬片放到用过的细胞培养皿里，PBS洗3次，4%冷的多聚甲醛固定20 min，弃固定液，PBS洗3次；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3次；血清封闭30 min，PBS洗3次；加一抗，4 ℃湿盒内过夜，PBS洗3次；加二抗，37 ℃湿盒内1 h，PBS洗3次，甘油封片，照荧光片。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0软件包进行统计学分析。结果以 ±s表示，两样本比较采用成组t检验，相关分析采用pearson分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WST-1法检测AA对NRK-52E细胞的增殖抑制率

结果显示，保持AA作用24 h情况下，随着AA浓度增加，细胞增殖抑制率明显增加；保持AA 10μg/mL作用浓度不变的情况下，随着作用时间的延长，AA对细胞的增殖抑制率明显增加，提示AA抑制NRK-52E细胞增殖具有浓度和时间的依赖性，见图1。

图1 AA对NRK-52E细胞增殖的抑制情况

2.2 Hoechst 33258染色观察AA对NRK-52E细胞凋亡的作用 与对照组细胞相比，AA 1μg/mL干预组的细胞出现凋亡小体，AA 10μg/mL干预组的细胞凋亡特征更明显，且细胞数量明显减少，提示AA能诱导肾小管上皮细胞凋亡，且在作用时间相同的情况下，高浓度AA诱导凋亡的作用更显著，见图2。

图2 Hoechst 33258染色检测AA诱导大鼠NRK-52E细胞凋亡（×400）

2.3 AA对肾小管上皮细胞胶原累积的影响 细胞免疫荧光及其相对定量结果显示，与对照组相比，10μg/mL AA作用NRK-52E细胞后，细胞外基质成分III型胶原的表达明显增多（P＜0.05），提示肾小管上皮细胞出现纤维化样改变，见图3。

图3 细胞免疫荧光检测AA诱导大鼠NRK-52E细胞表达III型胶原情况

2.4 AA促进促纤维化因子TGF-β1 mRNA和蛋白的表达 ELISA法检测结果显示，5μg/mL和10μg/mL AA作用24 h后，TGF-β1的表达量较对照组明显升高（P＜0.05）；real-time RT-PCR结果也显示，10 μg/mL AA干预组中TGF-β1 mRNA的表达量较对照组明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组间TGF-β1蛋白和mRNA以及Rac1蛋白表达量比较（ ±s）

2.5 AA影响肾小管上皮细胞分泌Rac1蛋白 ELISA法检测结果显示，不同浓度AA作用NRK-52E细胞后，Rac1蛋白的表达均升高；细胞免疫荧光染色结果也显示AA促进了小管上皮细胞分泌Rac1蛋白，见表1和图4。

图4 Rac1在AA损伤肾小管上皮细胞过程中的表达改变

2.6 Rac1蛋白与TGF-β1的相关性分析 采用Pearson法分析上清液中Rac1和TGF-β1蛋白含量的相关性，结果发现，Rac1和TGF-β1含量存在明显正相关关系（r=0.967，P=0.007）。

3 讨论

AA是硝基菲类有机酸化合物，在中药马兜铃、广防己、关木通和中成药龙胆泻肝丸、当归四逆丸、大黄清胃丸等中均有检出。使用AA类药物能引起广泛的肾间质纤维化，进而引起急慢性肾功能衰竭，即马兜铃酸肾病。然而，目前对AA诱发肾间质纤维化机制的认识尚不清楚，大致涉及以下几方面[5]：胞质毒学说、肾缺血学说、细胞凋亡学说、肾小管上皮细胞转分化学说。我们的研究显示，AA作用于肾小管上皮细胞，可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。可能的机制之一为AA导致DNA损伤和细胞周期阻滞于G2/M期，从而诱导细胞凋亡[6]。除了诱导肾小管上皮细胞凋亡外，我们还发现AA可促进III型胶原的表达，引起纤维化样改变。对于这种现象，Yang等[6]认为AA刺激JNK信号通路的活化，进而诱发TGF-β1的表达是主要因素。而我们的研究显示，AA损伤肾小管上皮细胞不仅表现为TGF-β1表达的上调，同时还伴有Rac1蛋白的高表达，提示Rac1蛋白很可能也是AA引起纤维化样改变的一个重要分子机制。

Rho蛋白为小分子鸟苷酸结合蛋白（又称小G蛋白），是Ras蛋白超家族成员。Rac蛋白是Rho家族小G蛋白的成员之一，有Rac1、Rac2、Rac3三种同工形式。Rac1和Rac3在体内广泛分布，而Rac2是一种造血细胞特异的小G蛋白[7]。TGF-β1是一种多功能细胞因子，可通过其蛋白激酶受体介导包括形态发生、胚胎发育、干细胞分化、炎症调节及伤口愈合在内的一系列生物过程，同时还能促进胶原累积，参与纤维化进程[2，8]。TGF-β1参与纤维化形成主要是与其受体结合，激活下游Smad复合体，调节相关基因的转录，即通过经典的Smad信号通路发挥作用[9]。除此之外，TGF-β1还可通过ERK-MAPK信号通路、GTPase Rho等发挥促纤维化功能[4，10]。Rac1作为GTPase Rho家族成员之一，也可能参与TGF-β1促肾纤维化的进程。已有研究表明，TGF-β1的高表达能活化Rac1介导的ERK通路，从而导致肾纤维化[10]。

但是，不同的Rho亚型在胶原累积过程中的作用可能不一样[11]。那么本研究中，Rac1蛋白在肾纤维化进程中到底发挥着怎样的作用？我们同时检测了Rac1蛋白和促纤维化因子TGF-β1的表达，并分析两者相关性。发现AA作用肾小管上皮细胞后，促纤维化因子TGF-β1和III型胶原表达明显增加，Rac1蛋白表达也增加，且与TGF-β1存在明显正相关关系，提示Rac1在AA所致肾间质纤维化中发挥正调控作用。可能的机制是AA损伤肾小管上皮细胞的情况下，Rac1及其介导的下游通路如ERK等，被TGF-β1表达和释放的增加所活化，进一步促进小管上皮细胞分泌表达胶原蛋白，出现纤维化反应。

综上所述，AA诱导胶原累积过程中，伴有Rac1蛋白的高表达，说明Rac1蛋白可能参与了纤维化过程。然而，Rac1蛋白及其相关信号通路在AA所致纤维化病变中的具体功能和定位，还需进一步的研究加以阐释。干预Rac1蛋白的表达可能成为AA致肾间质纤维化治疗的新途径。

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