溶血磷脂酸上调ROS水平诱导HeLa-S3细胞迁移及相关机制的探讨

姚慕崑，刘 玮，任萍萍，吴希美

(1.浙江省立同德医院，浙江 杭 州 310012;2.浙江大学医学院临床一系浙江，3.浙江大学医学院药理学系，杭州 310058)

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)在某些肿瘤的转移中具有一定的作用［1］，如LPA与其受体可促进乳腺癌向骨的转移［2］，同时其抑制剂可有效的逆转肿瘤细胞的迁移［3］，但目前对LPA促进肿瘤转移的机制还不清楚，因此本文采用LPA处理He-La-S3人宫颈癌细胞，观察其对HeLa-S3细胞的迁移能力以及胞内ROS水平的影响，并进行相关机制的探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂 HeLa S3人宫颈癌细胞(美国ATCC);二甲亚砜(DMSO)、AMD3100、溶血磷脂酸、牛血清白蛋白(BSA)、TritonX-100、LY294002、NAC(美国Sigma公司);HeLa S3专用培养基(美国biohermes公司);胰蛋白酶(美国Gibco公司);GAPDH、辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠二抗、兔二抗单克隆抗体(美国 SANTA CRUZ公司);Akt(lot 9272)、P-Akt(Ser473，lot 9271)、PAK1(lot 2602)、P-PAK1(Thr423，lot 2601)多克隆抗体(美国 Cell Sigaling Technology公司)。

1.2 细胞传代培养 将HeLa S3细胞接种于60 ml的细胞培养瓶中，用HeLa S3专用培养基进行培养。培养2～3 d后，待细胞生长为致密单层时，移除培养基，用PBS清洗细胞3次，并采用0.25%胰蛋白酶(37℃预热)消化细胞1 min，至倒置显微镜观察成圆形时，加入少量含血清的HeLa S3专用培养基终止整个消化过程，室温下离心(1 500 r·min－1×5 min)，弃上清，收集细胞沉淀。并向沉淀中加入专用培养基，按照5×108·L－1的密度将HeLa S3细胞接种到培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。

1.3 细胞迁移实验 收集对数期的HeLa S3细胞，经胰酶消化处理后，以5×105的细胞密度接种到96孔培养板中，使用专用培养基培养24 h(含血清)，使用移液器吸头沿培养板底部作简单“一”字形1 mm宽的人工划痕，并采用倒置显微镜观察并拍摄划痕边缘区域及相对距离;对细胞进行药物处理12 h后，并通过比较处理前后划痕边缘相对距离的差值来测定迁移能力。

1.4 ROS荧光检测 将高压灭菌处理过的盖玻片(22 mm×22 mm)置于6孔培养板底部，将HeLa S3细胞以3×108cells·L－1的密度接种到含专用培养基的6孔培养板中，置于37℃细胞培养箱进行常规培养;观察并当细胞完全展开贴壁后，改为无血清处理24 h;给予20 μmol·L－1的 LPA 处理不同的时间段，并与无血清培养基稀释好的CM-H2DCFDA(5 μmol·L－1)，在细胞培养箱中孵育(37℃×30 min);整个孵育过程需避光并采用PBS清洗和4%多聚甲醛固定(1 h)，放置荧光显微镜下观察。确定LPA的最强刺激时间 A，然后采用200 μmol·L－1NAC预处理1 h，LPA处理时间A，并重复以上步骤。

1.5 全蛋白提取 将细胞用预冷PBS清洗细胞2次，吸干后加预冷全蛋白提取缓冲液0.5 ml，冰上裂解细胞15 min;采用细胞刮刀刮取细胞后并多次吹打细胞使其悬浮，并将细胞悬液转移至EP管中，冰上振荡处理15 min;在4℃离心(12 000 r·min－1×20 min)，取上清，并采用BCA法测定蛋白浓度，－70℃保存备用。

1.6 Western blot实验 将上步提取的蛋白样品按照一定的比例与加样缓冲液混合，加热(100℃×5 min)后离心3 min，取上清加样后进行蛋白电泳;采用10%SDS-PAGE进行电泳，浓缩胶和分离胶的电压分别为80 mV和100 mV;采用半干转法进行转膜(20 V);采用5%脱脂蛋白封闭，Blot缓冲液洗膜(5 min×3次);加入一抗孵育(1 ∶300)，Blot缓冲液洗膜后，在加入二抗(1∶3 000)，同样也采用Blot缓冲液洗膜，采用ECL法来显色处理，胶片曝光后观察蛋白的条带。然后将膜上洗脱，重复上述步骤，进行GAPDH蛋白的条带显影，并采用Gel-Pro analyzer进行各显影条带的光密度分析。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，且所有数据均以±s的形式表示，采用成组t检验分析两组之间的差异，采用单因素方差分析(one way ANOVA)进行多组之间比较。

2 结果

2.1 LPA刺激对HeLa-S3细胞迁移和ROS的影响 分别给予细胞为期15、30、60、75、120 min的20 μmol·L－1LPA刺激发现，LPA可促进 HeLa-S3细胞ROS的合成，且差异具有统计学意义，见Fig 1。在给予200 μmol·L－1NAC(ROS 生成抑制剂)预处理60 min后，发现LPA促进胞内ROS生成被抑制，同时细胞的迁移能力减弱，与LPA单纯处理差异有统计学意义(P＜0.05)，见 Fig 2、3。

2.2 LPA刺激对Akt磷酸化的影响 LPA刺激后，Akt的Ser473磷酸化位点被持续的激活，在15 min 达到峰值，P-Akt(Ser473)/Akt在 5、15、30、60 min差异均有显著性(P＜0.05);Akt蛋白总量在各时间点的表达无显著性差异(P＞0.05)(Fig 4)，各组蛋白条带的灰度值见Tab 1。

2.3 LPA刺激对PAK1磷酸化的影响 LPA刺激后，P-PAK1(Thr423)/PAK1水平升高，且与对照组差异有显著性(P＜0.05);且采用LY294002(PI3K抑制剂)预处理(15 min)可抑制P-PAK1(Thr423)/PAK1 的上调(Fig 5，Tab 2)。

Fig 1 Intracellular ROS level of different time points treated by LPA

Fig 2 Influence on intracellular ROS level andmigration ability of pretreatment with NAC

2.4 LY294002预处理对LPA诱导细胞迁移的影响 单独使用LPA可增加HeLa-S3细胞的迁移，而LY294002预处理可抑制LPA诱导细胞迁移的作用，且单独使用LY294002预处理(15 min)可降低细胞的迁移(Fig 5)。

3 讨论

研究表明，LPA可通过多种途径来促进肿瘤的发生与侵袭［4－5］，常见的方式:(1)抑制肿瘤细胞凋亡，促进原位增殖，如研究发现LPA可抑制癌细胞Caspases的活性［6］，加速 p53 的凋亡［7］以及上调Bcl-1的表达［8］，造成原癌基因在同抑癌基因的对抗中占优势;(2)通过提供肿瘤生长所需的营养物质来促进肿瘤血管的生成［9］;(3)提高肿瘤的迁移能力等［10］;肿瘤高侵袭能力是导致肿瘤手术切除效果不理想，生存率低的首要因素，因此需要对肿瘤迁移的相关机制进行研究。

本研究发现LPA刺激可促进宫颈癌HeLa-S3细胞的迁移，在20μmol·L－1的LPA处理下发现细胞内的ROS生成增高，在采用抗氧化剂NAC处理后，发现LPA上调胞内ROS生成的作用减弱，以上这些结果表明LPA能诱导细胞内ROS的产生。很多研究表明ROS在癌细胞的增殖以及由EGF诱导的癌细胞迁移中均有重要的作用［11］，这与本研究的结果一致，提示LPA可能通过促进ROS的生成来促进HeLa-S3细胞的迁移，采用NAC预处理后，发现LPA促进HeLa-S3细胞的迁移的能力受到抑制，这与前面的推断一致，因此认为LPA促进HeLa-S3细胞的迁移是通过ROS来发挥作用的。

Fig 3 Original pictures of intracellular ROS and cell migration in different treatment

Tab 1 Optical density of Akt protein on different time points treated by LPA

Tab 2 Optical density of PAK1 protein in four groups

Fig 4 Influence on phosphorylation of Akt on different time points treated with LPA

Fig 5 Influence on P-PAK1/PAK1 level and migration ability of pretreatment with LY294002

以往的研究表明［12］，大多数的肿瘤细胞PI3K/Akt/PAK1是激活的，而且在肿瘤细胞的迁移中发挥着重要的作用。本研究发现在LPA预处理后，Akt呈时间依赖性激活，且在5 min～60 min被明显激活，而通过对其下游的PAK1研究表明，其水平也被明显的激活，而给予PI3K的抑制剂LY294002处理后，PAK1(Thr423)磷酸化水平降低，活性受到抑制，因此推测LPA可能通过激活PI3K/Akt/PAK1信号通路来促进细胞的迁移，而采用LY294002将此信号通路的上游PI3K抑制后，发现肿瘤细胞的迁移能力遭到抑制。因此认为PI3K/Akt/PAK1信号通路在LPA上调ROS水平诱导HeLa-S3细胞的迁移上具有重要的作用。

综上所述，LPA通过上调ROS来促进HeLa-S3细胞的迁移，且可能的机制是激活PI3K/Akt/PAK1信号通路，为肿瘤细胞的迁移和治疗提供新的思路和靶点。

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