脾酪氨酸激酶——动脉粥样硬化新靶点及其药物研究

孙 丽，甘我挺，韩 欣，凌 霜，许锦文

(上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海 201203)

蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是一组能催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的酶蛋白，参与许多信号转导途径。脾酪氨酸激酶(Syk)是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，在多种细胞中表达，主要是血液细胞、血小板，其他如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞等。近年来的研究发现，Syk与血管内皮功能之间有重要联系，Syk对心血管疾病的发病及炎症反应过程具有重要意义，尤其与动脉粥样硬化(AS)的发病密切相关。同时，在研究中出现了越来越多的靶向于 Syk的药物，对Syk的研究也越来越深入。Syk很可能是抗动脉粥样硬化潜在的靶点，针对Syk的药物研发将是治疗AS药物发展的新方向之一。本文就Syk在动脉粥样硬化中的作用及其可能机制进行探讨，并对其相关药物研究进展进行综述。

1 Syk

Syk是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，在多种细胞中表达。Syk其编码基因为syk，位于人类染色体9q22，Syk mRNA全长2672 bp，含1个内含子和2个外显子。syk基因由Taniguchi等于1991年从猪脾cDNA克隆出来，其编码蛋白是一种非受体型酪氨酸激酶，故被命名为脾酪氨酸激酶。Syk包含629个氨基酸残基，分子量为72 ku，含有2个串联的SH2结构域及1个酪氨酸激酶结构域SH1。Syk通过SH2区域与依赖酪氨酸的免疫受体活化基序(ITAM)结合而活化。

Syk家族还有一种含量较少的、自然存在的亚型SykB，它比Syk少SH2结构域和激酶结构域之间的23个氨基酸残基(Insert)。ZAP-70蛋白为Syk家族另一成员，仅表达于T细胞和自然杀伤细胞，其结构中亦不含上述Insert。SykB在功能上更接近于ZAP-70。

Syk的细胞生物学功能主要包括:①抑制细胞的分裂与增殖;②对细胞迁移起重要作用;③影响某些细胞因子的分泌;④抑制肿瘤细胞的成瘤能力;⑤对细胞分化也有一定影响。Syk作为免疫受体的关键介质在炎性细胞中表达，与过敏性和抗体介导的自身免疫性疾病密切相关，Syk现已被作为潜在的慢性炎症性疾病如类风湿性关节炎、哮喘、B淋巴瘤的治疗靶点，新近的研究表明Syk在动脉粥样硬化的发生、发展过程中发挥重要作用，很可能是治疗动脉粥样硬化的新靶点。

2 Syk与动脉粥样硬化

Hilgendorf等［1］的最新研究认为抑制 Syk可降低AS的炎症过程，并降低斑块的发展。低密度脂蛋白受体缺陷小鼠进食高胆固醇的饮食，辅以Syk抑制剂fostamatinib 16周，结果动脉粥样硬化病变的大小与各自的对照组相比呈剂量依赖性减少到(59±6)%，同时fostamatinib治疗的动物的病变中含较少的巨噬细胞，由此提示，Syk抑制将作为一个潜在的、卓有成效的抗动脉粥样硬化的治疗策略。

2.1 Syk与氧化低密度脂蛋白 氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是动脉粥样硬化病变炎症反应中的重要决定因素，ox-LDL促使巨噬细胞吞噬大量脂质而成为泡沫细胞，并且由泡沫细胞累积而成的脂质核心认为是粥样斑块的主要成分［2］。Bae等［3］研究发现弱氧化修饰低密度脂蛋白(mmLDL)可诱导细胞内活性氧的产生，此过程是通过 TLR4、Syk、PKC及gp91phox/Nox2等通路实现的，并诱导促炎细胞因子的表达。Miller［4］等认为mmLDL参与TLR4的激活，导致Syk的募集反应和下游信号的激活，造成细胞骨架的重排和巨胞饮，而Syk依赖性的巨胞饮会导致过多的脂质沉积即泡沫细胞形成。由此可得出，Syk与泡沫细胞的形成密切相关，参与动脉粥样硬化的形成。

2.2 Syk与C-反应蛋白 C-反应蛋白(CRP)是动脉粥样硬化中炎症的敏感指标之一，近年发现 CRP自身直接参与动脉粥样硬化的进展过程，CRP刺激HUVEC和HCAEC的细胞间黏附分子-l(ICAM-l)、血管细胞黏附分子-l(VCAM-l)和 E-选择素(E-selectin)的表达［5］。另外，Xu 等［6］研究发现，重组CRP经由其受体CD64激活Syk，减弱胰岛素在血管内皮中的信号传递作用，抑制eNOS活性，从而抑制胰岛素诱导产生的NO，成为影响血管稳态的重要因素之一。CRP与血管内皮细胞上的受体FcγRI(CD64)和FcγRⅡa(CD32)结合，激活受体上的ITAM上的酪氨酸磷酸化，进而激活Syk和其他下游信号传导，上调IL-8的释放以及促使内皮细胞分泌多种炎症因子等［7］。

2.3 Syk与NF-κB的激活 在动脉粥样硬化形成过程中，血管壁的炎症为其主要特征，而NF-κB参与炎症过程中的多种信号传导途径，并且在动脉粥样硬化晚期参与平滑肌细胞增殖的生长因子亦可有NF-κB调控，因而认为NF-κB的激活是动脉粥样硬化发生发展的始动机制之一［8］。Brand利用新型的鼠抗体α-p65mAb首次证实了人动脉粥样硬化组织中有NF-κB的激活，并提出动脉粥样硬化可能是NF-κB介导的慢性炎症过程。Bijlik等［9］研究认为凝血酶作用血管内皮细胞后PKCδ激活Syk，再活化下游的NF-κB，并上调内皮细胞ICAM-1的表达。这提示Syk作为NF-κB的上游信号，对动脉粥样硬化的发展过程具有重要作用。

2.4 Syk与血小板活化及炎症小体的激活 血小板在止血和血栓形成中发挥重要作用，血小板活化与粥样硬化形成、血栓形成、心肌梗死和中风有着密切的联系。胶原的血小板结合会导致GPVI的聚集，促成Syk的磷酸化和被激活，继而发生跨膜衔接蛋白LAT的磷酸化，引发许多信号蛋白的聚集［10］。

Tab 1 Small molecule inhibitors of Spleen tyrosine kinase

炎症小体(inflammasome)是细胞内由多种蛋白寡聚形成的一个能激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1的多分子复合物。当炎症小体形成时，招募并活化caspase-1，促使对IL-1β、IL-18等细胞因子的加工与成熟化。研究表明，多种病原体，比如白色念珠菌，通过Syk激活NLRP3(NOD-like receptor containing pyrin domain 3 ，NLRP3)炎症小体［11］。Duewell等［12］对喂养高胆固醇饲料、易患动脉粥样硬化症的ApoE-/-小鼠所做一项研究表明，胆固醇晶体会出现在动脉粥样硬化的最早阶段，而且这些晶体能激发吞噬细胞的NLRP3炎症小体。这表明以Syk为靶点阻断炎症小体途径的策略可能是一个抗动脉粥样硬化治疗的新方法。

3 小分子Syk抑制剂

Syk是一种非受体型酪氨酸激酶，存在于许多细胞中，主要与炎症过程有关。近年来研究开发了许多 Syk抑制剂，部分已进入临床试验研究，但大多是用于治疗哮喘、风湿性关节炎等免疫性疾病，用于心血管疾病治疗的还较少。Tab 1的几个化合物显示了作用于Syk的基本骨架结构。

3.1 Rigel公司的系列化合物 R112、R406、R788 美国 Rigel公司新发现一类口服靶向Syk激酶抑制剂，对淋巴瘤、白血病及炎症性疾病如类风湿性关节炎(RA)等具有潜在的作用。Weinblatt等［13］报道了针对Syk的新型激酶抑制剂治疗RA的疗效和副作用。在啮齿类胶原诱发性关节炎模型中，R788(fostamatinib disodium)，一种口服前药，迅速转化为一种有效的、选择性强的Syk抑制剂(R406)有较强抗炎活性。另外，Rigel公司新的鼻内Syk抑制剂R112是一种有效的过敏性鼻炎替代治疗药。R112通过抑制Syk激酶阻断了肥大细胞对过敏性刺激原的反应［14］。

3.2 伊马替尼(格列卫) 这是新的一系列化合物中的第1个通过抑制Syk而不是非特异性抑制快速分化细胞发挥作用的化合物。伊马替尼是一种新型的抗慢性粒细胞白血病(CML)药物，此外，伊马替尼也用于治疗不能切除和(或)发生转移的恶性胃肠道间质瘤(GIST)的患者，成为公认的GISTs一线治疗药物。

3.3 Bayer 公司的 BAY61-3606 BAY61-3606［15］是 ATP 竞争性抑制剂，通过阻断Syk的催化活性起作用。开始用于治疗哮喘，现在正在开展治疗慢性白血病的研究［16］。

4 中药有效成分中Syk激酶抑制剂的筛选

心血管疾病的主要病理基础是动脉粥样硬化(AS)，从中草药中寻找防治AS的有效药物一直是人们关注的课题。研究发现，中药中的一些白藜芦醇类似物如Piceatannol、紫檀茋等可发挥针对Syk的抑制作用，具有抗炎、保护心血管的作用，其他的一些中药成分也具有类似作用，这为抗AS药物的开发提供了新的方向。

4.1 Syk 的特异性抑制剂-Piceatannol 3，3'，4，5'-四羟基反式二苯乙烯(Piceatannol)是Syk的特异性抑制剂，Piceatannol又被称为白皮杉醇、云杉鞣酚、3'-羟基白藜芦醇等，是一种在葡萄、大黄藓、大黄和甘蔗等中发现的多酚物质，该多酚化合物最早从大戟属植物Lagascae种子中分离得到。研究证实白皮杉醇具有多种生物活性，是一种具有抗白血病活性的植物代谢药，并可抑制非受体激活酶、脾酪氨酸激酶以及淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶。

白皮杉醇是白藜芦醇的3'羟基化类似物。白皮杉醇除了作为潜在的SIRTl激动剂［17］，也具有抗癌、防癌、抗细胞增殖、抗炎、免疫调节、抗脂质氧化、抗菌和抑制胃中H+-K+-ATP酶等［18-20］多种药理活性。

4.2 紫檀茋 紫檀茋(pterostilhene)和白藜芦醇同属芪类化合物，是白藜芦醇的3，5-二甲基衍生物。它广泛存在于广西血竭、葡萄和蜂胶中，具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、中等强度抑制 COX-1和COX-2和抗真菌等作用。Mizuno等［21］报道其对PPARa有激动作用，并能降低动物的胆固醇含量。

4.3 其他 近年来的研究显示，发现多种中药成分对Syk具有抑制作用。Chiou等［22］发现补骨脂定(Psoralidin)通过抑制Syk从而抑制LPS诱导的iNOS的表达。槲皮素下调Syk的活性［23］，大黄素抑制 Syk 的磷酸化［24］，鱼腥草水提物［25］及番石榴的乙酸乙酯提取物［26］可抑制抗原诱导的Syk的磷酸化，赤豆(Phaseolvs angularis)的乙醇提取物阻断上游信号分子Syk的活性发挥抗炎作用［27］，花楸属植物Sorbus commixta的水提物抑制 Src和Syk的活性及其磷酸化水平［28］。

中药中筛选出的Syk抑制剂在抗血栓、抗动脉粥样硬化、抗炎等方面发挥重要作用，尽管这些Syk的抑制剂尚缺乏确切的临床证据，但作为有抗动脉粥样硬化及抗肿瘤作用的天然活性物质，仍具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

5 问题与展望

综上所述，Syk在动脉粥样硬化的炎症反应过程中起着重要的调节作用。由于Syk在血液细胞和其他细胞内的广泛表达，以及它在细胞信号传导中的重要作用，尤其是在免疫受体信号转导通路，故Syk涉及到人类许多疾病，它的活性高低直接影响疾病的发生发展。因此利用分子生物学技术把Syk作为干预治疗靶点，将为动脉粥样硬化性疾病的治疗提供新策略和新方法。目前，中药已经在开展酪氨酸激酶抑制剂的筛选，但是对酪氨酸激酶抑制剂的筛选并没有区分受体型和非受体型;国内酪氨酸激酶抑制剂的筛选主要停留在抗肿瘤方面，将酪氨酸激酶引入心血管系统研究，将会为心血管系统疾病的研究提供新的靶点，从中药中筛选Syk抑制剂，进行系统、深入的研究，开发新一代抗AS药物将具有广阔的应用前景。

［1］Hilgendorf I，Eisele S，Remer I，et al.The oral spleen tyrosine kinase inhibitor fostamatinib attenuates inflammation and atherogenesis in low-density lipoprotein receptor-deficient mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31(9):1991-9.

［2］Heinecke J W.Lipoprotein oxidation in cardiovascular disease:chief culprit or innocent bystander［J］.J Exp Med，2006，203(4):813-6.

［3］Bae Y S，Lee J H，Choi S H，et al.Macrophages generate reactive oxygen species in response to minimally oxidized low-density lipoprotein:toll-like receptor 4-and spleen tyrosine kinase-dependent activation of NADPH oxidase 2［J］.Circ Res，2009，104(2):210-8，21p following 218.

［4］Miller Y I，Choi S H，Fang L，et al.Toll-like receptor-4 and lipo-protein accumulation in macrophages［J］.Trends Cardiovasc Med，2009，19(7):227-32.

［5］Pasceri V，Willerson J T，Yeh E T.Direct proinflammatory effect of C-reactive protein on human endothelial cells［J］.Circulation，2000，102(18):2165-8.

［6］Xu J W，Morita I，Ikeda K，et al.C-reactive protein suppresses insulin signaling in endothelial cells:role of spleen tyrosine kinase［J］.Mol Endocrinol，2007，21(2):564-73.

［7］Devaraj S，Du Clos T W，Jialal I.Binding and internalization of C-reactive protein by Fcgamma receptors on human aortic endothelial cells mediates biological effects［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(7):1359-63.

［8］石翠格，胡 刚，汪 海.NF-κB在动脉粥样硬化中的始动作用［J］.中国药理学通报，2004，20(4):382-5.

［8］Shi C G，Hu G，Wang H.Nuclear factor-κB and the pathegenesis of the atherosclerosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(4):382-5.

［9］Bijli K M，Fazal F，Minhajuddin M，et al.Activation of Syk by protein kinase C-delta regulates thrombin-induced intercellular adhesion molecule-1 expression in endothelial cells via tyrosine phosphorylation of RelA/p65［J］.J Biol Chem，2008，283(21):14674-84.

［10］Gibbins J M.Platelet adhesion signalling and the regulation of thrombus formation［J］.J Cell Sci，2004，117(Pt 16):3415-25.

［11］Gross O，Poeck H，Bscheider M，et al.Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence［J］.Nature，2009，459(7245):433-6.

［12］Duewell P，Kono H，Rayner K J，et al.NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals［J］.Nature，2010，464(7293):1357-61.

［13］Weinblatt M E，Kavanaugh A，Genovese M C，et al.An oral spleen tyrosine kinase(Syk)inhibitor for rheumatoid arthritis［J］.N Engl J Med，2010，363(14):1303-12.

［14］Meltzer E O，Berkowitz R B，Grossbard E B.An intranasal Syk-kinase inhibitor(R112)improves the symptoms of seasonal allergic rhinitis in a park environment［J］.J Allergy Clin Immunol，2005，115(4):791-6.

［15］Yamamoto N，Takeshita K，Shichijo M，et al.The orally available spleen tyrosine kinase inhibitor2-［7-(3，4-dimethoxyphenyl)-imidazo］［1，2-c］pyrimidin-5-ylamino nicotinamide dihydrochloride(BAY 61-3606)blocks antigen-induced airway inflammation in rodents［J］.J Pharmacol Exp Ther，2003，306(3):1174-81.

［16］Baudot A D，Jeandel P Y，Mouska X，et al.The tyrosine kinase Syk regulates the survival of chronic lymphocytic leukemia B cells through PKC delta and proteasome-dependent regulation of Mcl-1 expression［J］.Oncogene，2009，28(37):3261-73.

［17］Howitz K T，Bitterman K J，Cohen H Y，et al.Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan［J］.Nature，2003，425(6954):191-6.

［18］Murias M，Handler N，Erker T，et al.Resveratrol analogues as selective cyclooxygenase-2 inhibitors:synthesis and structure-activity relationship［J］.Bioorg Med Chem，2004，12(21):5571-8.

［19］Lu J，Ho C H，Ghai G，et al.Resveratrol analog，3，4，5，4'-tetrahydroxystilbene，differentially induces pro-apoptotic p53/Bax gene expression and inhibits the growth of transformed cells but not their normal counterparts［J］.Carcinogenesis，2001，22(2):321-8.

［20］Murias M，Jäger W，Handler N，et al.Antioxidant，prooxidant and cytotoxic activity of hydroxylated resveratrol analogues:structure-activity relationship［J］.Biochem Pharmacol，2005，69(6):903-12.

［21］Mizuno C S，Ma G，Khan S，et al.Design，synthesis，biological evaluation and docking studies of pterostilbene analogs inside PPARalpha［J］.Bioorg Med Chem，2008，16(7):3800-8.

［22］Chiou W F，Don M J，Liao J F，et al.Psoralidin inhibits LPS-induced iNOS expression via repressing Syk-mediated activation of PI3K-IKK-IkappaB signaling pathways［J］.Eur J Pharmacol，2011，650(1):102-9.

［23］Maccaglia A，Mallozzi C，Minetti M.Differential effects of quercetin and resveratrol on Band 3 tyrosine phosphorylation signalling of red blood cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，305(3):541-7.

［24］Lu Y，Yang J H，Li X，et al.Emodin，a naturally occurring anthraquinone derivative，suppresses IgE-mediated anaphylactic reaction and mast cell activation［J］.Biochem Pharmacol，2011，82(11):1700-8.

［25］Han E H，Park J H，Kim J Y，et al.Houttuynia cordata water extract suppresses anaphylactic reaction and IgE-mediated allergic response by inhibiting multiple steps of FcepsilonRI signaling in mast cells［J］.Food Chem Toxicol，2009，47(7):1659-66.

［26］Han E H，Hwang Y P，Kim H G，et al.Ethyl acetate extract of Psidium guajava inhibits IgE-mediated allergic responses by blocking FcepsilonRI signaling［J］.Food Chem Toxicol，2011，49(1):100-8.

［27］Yu T，Ahn H M，Shen T，et al.Anti-inflammatory activity of ethanol extract derived from Phaseolus angularis beans［J］.J Ethnopharmacol，2011，137(3):1197-206.

［28］Yu T，Lee Y J，Jang H J，et al.Anti-inflammatory activity of Sorbus commixta water extract and its molecular inhibitory mechanism［J］.J Ethnopharmacol，2011，134(2):493-500.