siRNA沉默β-arrestin2促进肝星状细胞凋亡

宋 杨，孙妩弋，胡姗姗，汪庆童，魏 伟

(安徽医科大学临床药理研究所，抗炎免疫药理学教育部重点实验室，抗炎免疫药物安徽省工程技术研究中心，安徽合肥 230032)

肝纤维化是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理变化，是影响慢性肝病预后的重要环节。肝纤维化的主要病理特征是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内的过量沉积［1］。目前认为，活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纤维化ECM的主要来源细胞。HSC在多种因素刺激后被激活转换成为肌成纤维样细胞，细胞大量增殖，合成ECM，并在肝内过量沉积，发生肝纤维化［2］。促进活化的HSC凋亡是防治肝纤维化的重要途径，HSCs的凋亡被认为是肝纤维化自我修复的中心环节。凋亡途径不但可以减少增生活化的HSC数量，使ECM分泌减少，而且凋亡的细胞可在数小时内被周围的细胞所吞噬，很少引起微环境的炎症损伤，是一种理想的清除增生HSC的方式［3］。

β-arrestins对绝大部分G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor，GPCR)介导的信号转导通路具有调节作用。越来越多的研究表明，β-arrestin除了调节GPCR信号通路以外，β-arrestin作为调节分子也在其他多种细胞内信号通路中发挥重要作用［4－5］。有研究表明，β-arrestin2 在细胞增殖中起重要调节作用［6－7］，β-arrestin2 还有抗细胞凋亡的作用，其能通过多种信号通路介导和调节细胞凋亡［8－9］。然而，β-arrestin2 对肝纤维化 HSC 凋亡的影响尚未见相关报道。本课题组在肝纤维大鼠的肝组织中β-arrestin2表达明显增强的先前研究基础上(另文发表)，采用脂质体转染技术，将体外合成的靶向 β-arrestin2的小干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)导入肝星状细胞株HSC-T6中，选择性沉默β-arrestin2基因，观察其对Bcl-2和Bax表达和HSC凋亡的影响，初步探讨siRNA β-arrestin2促HSC凋亡作用。

1 材料

1.1 细胞株 HSC-T6细胞为永生化大鼠肝星状细胞株，由上海肝病中医药研究所提供。

1.2 主要材料与试剂 Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品;抗 β-arrestin2抗体:购自 Santa cruz公司;抗 Bcl-2、Bax、β-actin 抗体:北京中杉金桥生物技术有限公司;预染蛋白质分子量标准:MBI Fermentas公司;辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L):北京中杉金桥生物技术有限公司产品;氟化聚偏乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)微孔转移膜:Millipore公司;SuperSignal West Femto Kit(超敏感底物发光试剂盒):Pierce公司，4℃保存。所有siRNA均由上海吉玛制药技术有限公司合成。RT-PCR引物由Invitrogen(上海)贸易有限公司合成;DMEM、FBS:GIBco公司产品;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)试剂盒:Fermentas公司产品;凋亡试剂盒:贝博生物公司。

1.3 仪器 Olympus IX-71型光学显微镜(日本);流式细胞仪(美国Beckman公司，FC500型);SpotAdvanced显微摄像系统(美国);电泳仪(DYY-10，北京六一仪器厂);Image-Pro plus图像处理系统;PCR仪(美国Biorad公司，My Cycler)。

2 方法

2.1 HSC-T6细胞培养和传代 HSC-T6细胞采用含有10% 胎牛血清的DMEM培养基，置37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞生长达80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。转染前24 h将处于对数生长期的HSC-T6细胞以5×105/孔接种于6孔板中。

2.2 siRNA瞬时转染HSC-T6细胞株

2.2.1 靶向 β-arrestin2的 siRNA设计与合成 根据β-arrestin2全基因序列设计4个siRNA序列如下:siRNA-1:正义链 5'-AGCGUGACUUUGUGGAUCATT-3'， 反 义 链 5'-UGAUCCACAAAGUCACGCUTT-3';siRNA-2:正义链5'-GACCGGAAAGUGUUUGUGATT-3'，反义链 5'-UCACAAACACUUUCCGGUCTT-3';siRNA-3:正义链5'-GACCGACUGCUGAAGAAGUTT-3'，反义链5'-ACUUCUUCAGCAGUCGGUCTT-3';siRNA-4:正义链 5'-UCGAGCCUUCUGUGCCAAATT-3'，反义链 5'-UUUGGCACAGAAGGCUCGATT-3'。

2.2.2 实验分组 实验共分3组:(1)空白对照组，以等体积的无牛血清无双抗DMEM培养液代替转染液，作为转染前β-arrestin2水平;(2)阴性对照组，以转染scrambled RNA的细胞观察β-arrestin2表达的变化;(3)siRNA β-arrestin2 组(R1、R2、R3、R4)，转染针对β-arrestin2的siRNA，特异性干扰目的基因β-arrestin2的表达。

2.2.3 转染 常规培养HSC-T6细胞至细胞密度达80%时，用无牛血清无双抗培养液分别稀释Lipofectamine 2000和siRNA至所需浓度(siRNA终浓度为20 μmol·L－1，分装，－20℃保存)，室温静置 5 min。将稀释后的siRNA与Lipofectamine 2000小心混匀，室温再静置20 min，使形成稳定的siRNA-脂质体混合物。随后弃去培养液，将上述混合物加入待转染细胞，6 h后更换为完全培养液继续培养。

2.3 RT-PCR检测 β-arrestin2 mRNA的表达 使用TRizol试剂提取细胞总RNA，并进行逆转录反应。PCR引物为 β-arrestin2:5'-CCACGTCACCAACAATTCTG(上游)，5'-TTGGTGTCTTCGTGCTTGAG-3'(下游);内参 GAPDH 5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'(上 游)，5'-AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3'(下游)。PCR条件:94℃ 5 min;94℃ 30 s;58℃ 30 s;72℃ 30 s;72℃ 10 min;4℃ 10 min(循环30次)。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4 Western blot检测 β-arrestin2、Bcl-2、Bax 蛋白的表达 收集细胞，加蛋白裂解液抽提细胞蛋白。Lowry法蛋白定量，每泳道20 μl蛋白上样进行SDSPAGE，在转移缓冲液中，以200 mA的电流转移到PVDF膜上。后封闭2 h，再加入抗β-arrestin2、Bcl-2、Bax单抗，4℃孵育过夜。洗涤后，继以辣根过氧化物酶结合的二抗室温孵育2 h，ECL试剂盒显色。用Image-Pro plus图像处理系统分析计算蛋白印迹值。

2.5 细胞凋亡的检测 采用AnnexinV/PI双染色法。消化收集各组细胞，PBS重悬细胞。按照试剂盒说明进行操作，流式细胞仪进行检测。图中右上象限为凋亡晚期或坏死细胞区，左下象限为活细胞区，右下象限为早期凋亡细胞区。测定3次，计算各组细胞的平均凋亡率。

2.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件，数据以±s表示，采用方差分析比较各组间差异。

3 结果

3.1 siRNA β-arrestin2 对 β-arrestin2 基因表达的抑制作用 RT-PCR结果经计算机灰度扫描并与内参照比较分析后显示，在转染siRNA3后HSC-T6 βarrestin2 mRNA较空白对照组和阴性对照组mRNA水平分别下降70% ±1.76%和69% ±1.93%，而在转染siRNA1、siRNA2和siRNA4后mRNA下降不明显。提示 siRNA3 β-arrestin2 对 β-arrestin2 mRNA表达有抑制作用。阴性对照组灰度与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见Fig 1。

3.2 siRNA β-arrestin2 对 HSC-T6 细胞 β-arrestin2蛋白表达的抑制作用 Western blot分析结果显示，HSC-T6在转染siRNA2和siRNA3后β-arrestin2蛋白表达被抑制了29.00% ±1.68%和68.43% ±2.88%，而阴性对照组及空白对照组细胞的β-arrestin2蛋白表达无明显变化，与 β-arrestin2 mRNA下降趋势基本相同(见Fig 2)。

Fig 1 Transcriptional expression of the β-arrestin2 in the stable HSC-T6 cells transfected with β-arrestin2 siRNA

Fig 2 Protein level of the β-arrestin2 in the HSC-T6cells transfected with β-arrestin2 siRNA

3.3 siRNA β-arrestin2 对 HSC Bcl-2 和 Bax 表达的影响 Fig 3结果表明，转染siRNA3的HSC-T6细胞β-arrestin2 Bcl-2表达被抑制了32.58% ±3.46%(P＜0.01)，Bax的表达增加了38% ±3.72%(P＜0.01)，而阴性对照组与空白对照组细胞比，Bcl-2和Bax表达无变化。

Fig 3 Effects of silencing HSCs β-arrestin2 gene on the expression of Bcl-2，Bax

3.4 siRNA β-arrestin2 对 HSC-T6 细胞凋亡的影响 流式细胞术分析表明，正常组细胞的凋亡率为3.5%，阴性对照细胞的凋亡率为4.7%。与未转染组相比，转染siRNA β-arrestin2处理组细胞凋亡率明显增加达37.5%(Fig 4)。

4 讨论

HSC的激活及ECM的大量产生是肝纤维化的中心环节，因此，寻找促进HSC凋亡的途径是防治肝纤维化的重要策略。大多数研究表明［10－11］，活化的HSC主要通过凋亡途径消除，是纤维化消退的主要机制。Bcl-2基因家族在调节细胞凋亡中发挥重要作用。Bcl-2是重要的凋亡抑制基因，Bax是Bcl-2基因家族中重要的凋亡促进基因，其基因产物Bcl-2、Bax是重要的凋亡调控蛋白。Bcl-2和Bax互为负相关，Bcl-2/Bax比例高低决定了细胞凋亡的方向即抑制凋亡或是促进凋亡［12－13］。

Arrestins是一种分子量为48～55 ku的可溶性蛋白。在脊椎动物中，Arrestins家族包括两种仅表达在视网膜杆状和锥状体感光细胞的Arrestin 1、Arrestin 4，和广泛表达于各组织的β-arrestins，包括βarrestin1和β-arrestin2(也称作Arrestin 2和Arrestin 3)。β-arrestins为多功能蛋白，不仅能引起GPCRs的脱敏和内吞以调节GPCRs信号转导，还可以调节其他一些非GPCRs跨膜受体的信号转导途径调节细胞的增殖，凋亡等多种功能活动［14－16］。本课题组先前研究了β-arrestins在大鼠肝纤维化发展过程中的变化，结果发现随着肝纤维化的发展，β-arrestin2表达明显增加，而β-arrestin1表达无明显变化。结果提示β-arrestin2在肝纤维化的发生发展中起着重要的作用。

Fig 4 Effects of siRNA β-arrestin2 on the apoptosis of HSC-T6

β-arrestin2不仅参与调节GPCRs信号转导，而且作为支架蛋白调节许多信号通路发挥其抗凋亡的作用［17－18］。有研究表明在非活化和活化的CD4+T细胞中β-arrestins促进Bcl-2的表达［19］。另有研究表明［20］，在DEN诱发的小鼠肝癌模型中，肝脏 βarrestin2表达明显增加，其可能通过增加Bcl-xL和减少Bax的表达，抑制p53导致抗凋亡作用。p53的激活的下游信号通路涉及许多细胞凋亡相关蛋白，有Bcl-xl(抗凋亡，Bcl-2的家庭成员)，Bax(促凋亡)，p53的凋亡调节作用是通过上调Bax和下调Bcl-2或Bcl-xL等实现的，通过他们的相互作用调节着细胞线粒体的通透性，从而影响着下游的促凋亡基因的功能［21－22］。β-arrestin2 可能通过调节MDM2蛋白的亚细胞定位，β-arrestin2的低聚物可以调节p53的功能［23］，因此β-arrestin2可能通过影响p53的功能，继而影响细胞增殖和凋亡等功能。

本实验结果显示，在 siRNA β-arrestin2转染HSC后，细胞内Bcl-2基因蛋白表达下调，而Bax基因表达上调，表明β-arrestin2干扰具有影响两种凋亡因子介导细胞凋亡信号通路的作用。通过流式细胞仪检测 AnnexinV/PI双染细胞凋亡，显示转染siRNA β-arrestin2的HSC-T6细胞凋亡率明显上升。以上研究结果提示β-arrestin2干扰能通过改变活化HSC的信号转导通路促进肝细胞凋亡。因此，siRNA介导的β-arrestin2沉默可能对肝纤维化具有潜在治疗前景。

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