人参皂甙Rg1对大鼠海马神经元缺糖氧/复糖氧后氧化损伤的保护作用①

何斌，吴鸿浩，吕金如，孙昊，吴昊，蒋雷，王淦楠，胡德亮，张劲松，陈彦

脑缺血卒中是临床常见的高危疾病，涉及多种病理生理机制，其中氧化应激是引发神经元死亡级联反应的主要原因之一。体外研究发现，海马神经元缺糖缺氧再灌注损伤后，过氧化物大量生成，谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量减少，以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GPx)活性降低，体内氧化及抗氧化系统平衡破坏，进而引发神经元死亡级联反应[1]。人参皂甙Rg1是人参活性成分中已提纯的重要单体活性成分，对缺血脑组织具有保护作用[2]。另有体外实验表明，人参皂甙Rg1可通过抗氧化反应，发挥抗衰老、保护帕金森病黑质神经元等药理作用[3-4]。本实验旨在海马神经元缺糖氧/复糖氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD-R)模型基础上，探讨人参皂甙Rg1对脑缺血后抗氧化能力的影响及其机制，提供人参皂甙Rg1脑保护作用和脑缺血病理机制方面的研究资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生24 h内SD乳大鼠，雌雄不限，SPF级，由南京医科大学实验动物中心提供。

1.2 试剂与配液 人参皂甙Rg1(中国药科大学分离纯化)；GSH、GPx测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；多聚赖氨酸、谷氨酰胺、胰酶(SIGMA公司)；马血清、DMEM、Neurabasal、B27(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；其余为国产分析纯。

解剖液：NaC1(124 mmol/L)、KC1(5 mmol/L)、CaCl2(2.4 mmol/L)、 MgSO4(1.3 mmol/L)、 NaH2PO4(1.25 mmol/L)、NaHCO3(26 mmol/L)和 D-Glucose(10 mmol/L)，调节pH至7.4；培养液：80%高糖型DMEM(含Glu 4.5 g/L)、10%马血清、10%胎牛血清、谷氨酰胺100µg/ml、青链霉素100 U/ml；培养液：98%Neurabasal培养基、2%B27无血清培养添加剂。

1.3 海马神经元无血清培养 取新生24 h内的乳大鼠，消毒，分离出海马组织，在预冷解剖液中剔除其血管、结缔组织等，清洗、剪成约1×1×1 mm小块。将其转入含解剖液2 ml的离心管中，加入0.25%胰酶2 ml(终浓度是0.125%)，混匀，37℃消化20 min。加入4 ml预冷种植培养液中止消化，用细口吸管吹打20下左右，过200目不锈钢网筛，1000 r/min离心10 min，弃上清液，加入4 ml种植培养液重悬细胞，吹打，过200目不锈钢网筛，收集细胞悬液。取细胞悬液0.1 ml以台盼兰拒染法进行活细胞计数，以2×105~5×105/ml的密度接种于多聚赖氨酸包被过的直径35 mm培养皿和96孔板中，贴壁2 h后每孔加种植培养液1 ml或0.1 ml。置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养，24 h后换为无血清培养液，以后每周换液2次，每次更换一半培养液。

1.4 海马神经元OGD-R模型制备 海马神经元培养8~10 d，随机分为正常对照组、模型组、人参皂甙Rg1干预组(低、中、高剂量组)。将模型组及人参皂甙Rg1干预组培养液换为低糖型DMEM(含葡萄糖≤1 g/L)，后者于缺糖缺氧前30 min加入人参皂甙Rg1 5µmol/L、20µmol/L、60µmol/L。两组神经元放置在密闭缺氧盒中，充入5%CO2氮气，流速约2 L/min，并置于37℃培养箱中培养约2.5 h。复糖氧时将培养液重新换为高糖含氧的DMEM，在正常培养条件下继续培养6 h或24 h。正常对照组仅将培养液更换为高糖型DMEM，其余条件不变。

1.5 GSH、GPx测定 于再灌注6 h中止培养，用细胞刮刀收集细胞，PBS洗涤细胞1次，后用裂解液裂解细胞，4℃、12000 r/min离心10 min取上清，按试剂盒说明检测GSH、GPx。

1.6 海马神经元细胞凋亡检测 按照Hoechst荧光染色试剂盒要求操作，于再灌注24 h时吸出细胞培养液，加入0.5 ml固定液4℃过夜，去固定液，加0.5 ml Hoechst 33258染色液染色5 min，在倒置荧光显微镜下观察细胞形态，每次随机计数3个视野内200个细胞，计阳性凋亡细胞百分率。

1.7 四甲基偶氮唑盐(MTT)代谢率测定 再灌注24 h时，于96孔培养板每孔加入MTT磷酸缓冲液20µl，至浓度0.5 mg/ml，继续培养4 h，去除上清液，每孔加入二四基亚砜100µl，溶解生成的深蓝色结晶，用酶标仪在490 nm处测定吸光值。

1.8 统计学分析 采用SPSS 11.5软件进行统计分析，组间差异采用One-wayANOVA，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 海马神经元形态学观察 在倒置显微镜下，刚接种的海马神经元为圆形，体积小，胞体透亮，光晕明显；2 h后细胞开始贴壁；24 h后活性好的细胞全部贴壁，神经元长出短小的突起，周围见扁平状多边形的神经胶质细胞；3~4 d后大多数胶质细胞死亡，处于底层，上层的神经元大多呈梭形、锥形、少数呈多边形，体积明显增大，突起增多、伸长；培养至8~10 d，神经元胞体饱满，轴突成熟，交织成网状，可进行试验，见图1。

2.2 海马神经元GSH含量 再灌注后6 h，模型组和人参皂甙Rg1各剂量组海马神经元GSH较正常对照组降低(P<0.05)；人参皂甙Rg1中、高剂量组神经元GSH含量显著高于模型组(P<0.001)，而低剂量组与模型组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.3 海马神经元GPx活性 再灌注后6 h，模型组和人参皂甙Rg1各剂量组GPx活性均显著低于正常对照组(P<0.001)；人参皂甙Rg1中、高剂量组神经元GPx活性显著高于模型组(P<0.001)，而低剂量组与模型组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.4 海马神经元凋亡率 经Hoechst染色后，荧光显微镜下凋亡细胞胞核浓缩，较正常细胞核明亮，见图2~图6。复糖氧24 h后，各组海马神经元凋亡率比较见表1。模型组及人参皂甙Rg1各剂量组神经元凋亡率显著高于正常对照组(P<0.001)；人参皂甙Rg1中、高剂量组凋亡率较模型组显著减少(P<0.001)，而人参皂甙Rg1低剂量组较之无显著性差异。人参皂甙Rg1三剂量组之间凋亡率比较，中、高剂量组间无显著性差异(P>0.05)，但均较低剂量组显著减少(P<0.001)。见表1。

2.5 海马神经元存活率 应用MTT测定复糖氧24 h后神经元存活率。模型组及人参皂甙Rg1各剂量组神经元存活率显著低于正常对照组(P<0.001)；人参皂甙Rg1中、高剂量组存活率较模型组显著升高(P<0.001)，而人参皂甙Rg1低剂量组较之无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组6 h后GSH含量、GPx活性及24 h后海马神经元凋亡率、存活率比较

3 讨论

发生脑缺血/再灌注时，受损脑组织发生氧化应激反应，并产生大量的活性氧(reactive oxygen species)，如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢(H2O2)等，大量活性氧可与细胞脂质、蛋白及核酸发生反应，造成细胞死亡/凋亡。机体可通过一系列抗氧化酶及抗氧化分子清除ROS：超氧化物歧化酶将超氧阴离子歧化为H2O2，H2O2进一步由GPx、过氧化氢酶清除。目前认为，GPx是神经元清除H2O2的主要过氧化物酶，该过程以GSH为底物。GSH在脑组织中含量丰富，在体大鼠模型研究发现，GSH缺失可加重脑缺血/再灌注脑损伤，而给予GSH类似物或GSH前体物可明显减轻损伤[5]。其可能的机制为，GSH是体内重要的抗氧化剂，可清除过量的氧应激产物，并且能与蛋白质形成二硫化物，后者被称为蛋白质谷胱甘肽化，谷胱甘肽化的蛋白质可降低神经元氧应激损伤[6]。此外，GSH还是调节氧化-还原转化的信号分子，GSH的缺失可导致Fos过表达，进而引起神经元凋亡[7]。本实验发现，再灌注后6 h GSH含量、GPx活性较高的神经元，其后受到的损伤较小，与以上观点一致。

人参是祖国传统中药资源中应用最为广泛的药物之一，人参皂甙Rg1是人参活性成分中已提纯的重要单体活性成分，已发现具有抗疲劳、抗衰老、抗癌、降血脂、增强记忆力、提高免疫力等药理作用。近几年人们发现人参皂甙Rg1可以经减少谷氨酸释放、抑制凋亡、营养神经等作用[8-10]，对抗脑缺血损伤。另有在体实验发现，人参皂甙Rg1具有抗氧化应激反应的功能，保护缺血再灌注的心、肾器官减轻损伤，并在抗衰老、保护帕金森病黑质神经元等方面发挥作用[3-4,11-12]。本实验通过离体细胞模型发现，人参皂甙Rg1减少脱糖氧再灌注神经元GSH、GPx的缺失，在脑缺血时也可发挥抗氧化作用，对抗脑缺血损伤。不过目前人参皂甙Rg1对缺糖氧神经元抗氧化作用的报道较少，其具体的作用机制尚需进一步研究明确。人参皂甙Rg1对脑缺血的保护作用可能涉及多项机制，根据本研究结果，我们认为人参皂甙Rg1可减轻缺糖氧神经元抗氧化成分的缺失，该机制可能在脑保护过程中发挥重要的作用。

综上所述，氧化应激反应在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。本实验经研究发现，人参皂甙Rg1可对抗脑缺血时的氧化损伤，保护脑组织，其机制可能与人参皂甙Rg1减轻GSH缺失、提高GPx活性有关。本实验结果丰富了人参皂甙Rg1的脑保护研究，但其具体作用机制还有待于进一步阐明。

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