更年平调液对更年期大鼠心肌细胞保护及 Bcl-2、Bax表达的影响

江 波，张端莲

（1.湖北省武汉市三医院中医科，武汉 430061；2.武汉大学基础医学院，武汉 430062）

更年平调液对更年期大鼠心肌细胞保护及 Bcl-2、Bax表达的影响

江 波1，张端莲2

（1.湖北省武汉市三医院中医科，武汉 430061；2.武汉大学基础医学院，武汉 430062）

[目的]探讨更年平调液对更年期大鼠心肌细胞保护作用的机制。[方法]选用鼠龄为11～15个月的自然更年期雌性SD大鼠，20只,随机分为2组，即更年平调液组（P组）、更年期对照组（M组）。另选鼠龄为4～6个月的SD大鼠，10只，为青年对照组（Y组）。药物干预第45天，采用免疫组织化学方法检测各组心肌组织中Bcl－2、Bax的表达，利用计算机图像分析技术测量各组心肌组织中Bcl－2、Bax的表达水平。[结果]更年平调液组Bcl－2、Bax的表达较更年期对照组差异有统计学意义（P＜0．01），更年平调液组与青年对照组比较Bcl－2、Bax的表达差异无统计学意义（P＞0．05）。[结论]更年平调液能抑制心肌细胞凋亡而对心肌细胞起着重要的保护作用。

更年平调液；心肌；更年期大鼠；Bcl-2；Bax；凋亡；免疫组织化学

更年期综合征是指更年期妇女卵巢功能逐渐衰退直至消失的一个过渡时期，由此引起的内分泌失调和植物神经功能紊乱是其主要证候，绝经是其主要标志，临床表现除月经紊乱、眩晕耳鸣外，还有胸闷烦躁、心悸气短、烘热出汗、失眠多梦或精神抑郁等一系列症状群[1-2]。中医学称其为“绝经前后诸症”，多发于45～55岁妇女期，根据症状的不同亦可归属于“心悸”、“脏躁”、“失眠”、“崩漏”等范畴。

中医认为：绝经前后，妇女“七七”任脉虚衰，太冲脉衰，天癸竭，肾气渐衰，肝肾功能不足，精血亏损，阴阳失调。因肾为先天之本，主藏精，主生长、发育与生殖。肝主要藏血,血化精。人体五脏六腑靠精血濡养，则身体健康。肝肾轼能亏损，精血不足，则表现诸证[3]。肝肾虚损，阴不制阳，肝阳上亢，则面赤烘热,烦躁易怒。阴虚生热则口苦、口干、多汗。肾阴亏损,则头晕目眩、腰膝酸软、失眠、多梦、记忆力减退。肝血不足,血不养筋脉,则关节疼痛,四肢麻木,阴阳失调。

更年期平调液经长期大量临床观察研究证实能明显改善更年期妇女的心血管症状，减慢心率，改善心室功能，但其作用机制尚未明确。

细胞凋亡是近年来的研究热点之一,也是多种疾病发生发展的重要环节,其中Bcl-2家族在细胞凋亡过程的作用的研究备受重视，Bcl-2和Bax是该家族中的重要成员,两者主要通过线粒体途径参与凋亡过程，当细胞受到各种刺激信号,与Bcl-2相结合的Bax就会被置换出来,线粒体膜通透性增加,释放出一系列物质,最终导致细胞死亡[4-5]。研究认为Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax的比值对于决定细胞接受死亡刺激信号后存活与否起关键性作用[6]。

本研究采用免疫组织化学方法，观察了更年期平调液对更年期大鼠心肌组织内凋亡调节蛋白Bcl-2、Bax的表达水平，探讨更年平调液对更年期大鼠心肌保护作用的可能机制，以期为临床运用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 更年平调液组（P组，n=10）：SD大鼠，雌性，鼠龄为11～15个月，经阴道细胞涂片证实属更年期，给予更年平调液组干预，为治疗组。更年期对照组（M组，n＝10）：大鼠选取同更年平调液组，给与生理盐水，为阴性对照组。青年对照组（Y组，n＝10）：SD大鼠，鼠龄为4～6个月，雌性。

各组处理方案：P组按照20mL/kg体质量给与更年平调液灌胃，每日1次,连续45d；M组按照20mL/kg体质量生理盐水灌胃，每日1次，连续45d；Y组处理方法同M组。最后1次灌胃后24h，麻醉取心肌组织做免疫组织化检测。

1.2 实验用药 更年平调液由枸杞子、肉苁蓉、制何首乌、女贞子及龙齿等12味中药组成,由武汉大学中南医院中药房配制（广州济光制药,批号900803）。

1.3 主要试剂和仪器 浓缩型兔抗鼠Bcl-2、Bax单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）；超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新公司）；YWY781型医用微波仪（浙江临安电子器材厂）；家用高压锅。

1.4 实验方法 将各组药物干预的大鼠麻醉处死，取脏，切成小方块用10%甲醛固定，组织切片，常规脱蜡，蒸馏水洗；3%过氧化氢，常温孵育10min，磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗4次，每次5min；10%正常山羊血清（PBS稀释）室温孵育10min，去血清，勿洗；滴加一抗37℃孵育1.5h，PBS洗4次，每次5min；滴加生物素标记的二抗工作液，37℃孵育20min，PBS洗4次，每次5min；滴加辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液37℃孵育20min，PBS洗4次，每次5min；DAB显色液显色，自来水充分冲洗；苏木精复染，脱水，透明，封片。

1.5 结果判断 心肌细胞胞浆出现棕黄色颗粒为抗体标记的Bcl-2、Bax阳性反应，对Bcl-2、Bax表达阳性的切片进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的视野（×400），用软件检测每个视野下阳性反应面积和所有细胞总面积，根据各组阳性表达情况分别计算阳性面积率（阳性面积率＝单位面积中阳性反应总面积/单位面积中细胞的总面积× 100%）。

1.6 统计学处理 实验数据用SPSS18.0统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bcl-2的表达 更年平调液组心肌细胞胞浆内可见深棕黄色密集颗粒，说明Bcl-2呈强阳性表达（见图1）；更年期对照组心肌细胞胞浆内无明显棕黄色颗粒，说明Bcl-2无表达（见图2）；青年对照组心肌细胞胞浆内可见淡黄色颗粒密集，Bcl-2呈阳性表达（见图3），较更年平调液组稍弱。分析结果经q检验，更年平调液组与更年期对照组Bcl-2的表达差异有统计学意义（P＜0.01)，更年平调液组与青年对照组比较Bcl-2的表达差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

表1 更年平调液对更年期大鼠心肌细胞Bcl-2表达的平均吸光度和阳性面积率（±s）Tab.1 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on the average OD and rate of positive area in expression of Bcl-2 in myocardial cell of rats with climacteric（±s）

表1 更年平调液对更年期大鼠心肌细胞Bcl-2表达的平均吸光度和阳性面积率（±s）Tab.1 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on the average OD and rate of positive area in expression of Bcl-2 in myocardial cell of rats with climacteric（±s）

注：更年平调液组与更年期对照组比较，*P＜0.01；更年期对照组与青年对照组比较，#P＜0.01。

组别 n 平均吸光度（A值） 阳性面积率（%）更年平调液组（P组） 10 0.4037±0.0613* 33.42±6.42更年期对照组（M组） 10 0.1041±0.0063# 10.13±5.40#青年对照组（Y组） 10 0.4086±0.0594## 33.32±5.07##

2.2 Bax的表达 更年平调液组心肌细胞胞浆内未见明显的棕黄色颗粒，Bax呈低表达（见图4）；更年期对照组心肌细胞胞浆内可见棕黄色密集颗粒，Bax呈阳性表达（见图5）；青年对照组心肌细胞胞浆内未见棕黄色，Bax无表达（见图6）。图像分析结果。

经q检验，更年平调液组与更年期对照组比较Bax的表达差异有统计学意义（P＜0.01），更年平调液组与青年对照组比较Bax的表达异性无统计学意义（P＞0．05），见表2。

表2 更年平调液对更年期大鼠心肌细胞Bax的表达的平均吸光度和阳性面积率（±s）Tab.2 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on OD and the rate of positive area in expression of Bax in myocardial cell in rats with climacteric（±s）

表2 更年平调液对更年期大鼠心肌细胞Bax的表达的平均吸光度和阳性面积率（±s）Tab.2 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on OD and the rate of positive area in expression of Bax in myocardial cell in rats with climacteric（±s）

注：更年平调液组与更年期对照组比较，*P＜0.01。更年期对照组与青年对照组比较，#P＜0.01。

组别 n 平均吸光度（A值） 阳性面积率（%）更年平调液组（P组） 10 0.1171±0.0504* 19.14±5.26更年期对照组（M组） 10 0.3271±0.0173# 41.06±14.68#青年对照组（Y组） 10 0.1163±0.0534## 17.32±4.79##

3 讨论

妇女更年期是指月经完全停止前数月或数年至绝经后若干年的一段时间,在月经将绝未绝的1～2 a间，部分妇女将会出现植物神经系统、内分泌系统等紊乱为主的临床症状群，主要表现为阵发性烘热出汗、盗汗、烦躁易怒、头晕目眩、忧郁、精神萎靡等症状，这些统称为更年期综合征[7]。在此时期，部分妇女由于雌激素减少引起骨质疏松以及因植物神经功能紊乱而出现胸闷、心悸气短等心血管系统症状[8-9]。

中医学认为，更年期综合征是女子七七天癸竭，肾气衰，月经将闭，肾气渐衰，冲任虚损，精血不足，调节阴阳相对平衡的机能失常，辨证施治,予以补肾法疗法[10]，同时还认为肾为元阴元阳，肾在下焦，属水，心在上焦，属火，肾中之阴上升至心，则能涵养心阴，心中之阳下降至肾，能温养肾阳，对于更年期综合征的患者，予以补肾药的同时给与归心、肝的药，可以平衡阴阳，调节冲任。

细胞凋亡，是各种细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，引起内源性DNA内切酶的激活而发生细胞的自然死亡[11]。细胞凋亡的过程是一种多种因子参与调节的过程，其中研究认为bcl-2家族被认为是调节细胞凋亡的关键基因，bcl-2家族包含两种功能调控基因：以bcl-2为代表的抑制凋亡基因和以Bax为代表的促进凋亡基因，Bax蛋白具有对抗Bcl-2，抑制细胞凋亡的能力。

Bcl-2基因最早是从滤泡性B细胞淋巴瘤中分离出来的一种原癌基因[12]，Vaux等[13]首先发现Bcl-2基因能延长细胞的存活时间，后有诸多研究显示Bcl-2基因可抑制多种组织细胞的凋亡，故称其为凋亡抑制基因。Bcl-2主要存在于线粒体膜、核膜和内质网膜上，Bcl-2蛋白羧基端的跨膜区域对Bcl-2蛋白发挥抑制凋亡功能起决定性作用。其机制可能是：1）Bcl-2蛋白位于线粒体上，通过抑制氧自由基的产生或起一种抗氧化剂的作用，而产生抗凋亡作用[14]。2）细胞凋亡中DNA的消化需要相关的Ca2+依赖性核酸内切酶参与，Bcl-2通过阻断Ca2+从内质网释放实现对细胞凋亡的抑制[15]。3）细胞凋亡时伴有细胞内细胞色素C减少及线粒体内细胞色素C增加，而Bcl-2主要定位于线粒体上，Bcl-2可能通过影响线粒体释放细胞色素C的过程来调节凋亡[16]。Bax是Bcl-2家族中的一个重要成员，其与Bcl-2有21%的同源性，由192个氨基酸组成，其C-端含有疏水氨基酸组成的跨膜区域[17-18]。研究发现Bcl-2家族成员蛋白共同点是在蛋白链上都存在3个结构基序，分别称为BH1、BH2和BH3结构域[19]。Bcl-2和Bax的突变分析表明，保守的BH结构域是蛋白具有异源或同源二聚体形成的关键区域。同时研究认为Bcl-2与Bax比例决定了细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡，若Bcl-2和Bax表达量平衡，形成的Bcl-2/Bax异源二聚体占优势，若Bcl-2过度表达而Bax表达不相应增多,会使细胞凋亡趋势减弱，而细胞存活期延长；若Bax过表达，而Bcl-2表达不相应增多，则诱发凋亡，Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素,Bcl-2和Bax共同协调从而调节细胞凋亡[20]，因此Bax与Bcl-2的比值决定了细胞对凋亡刺激的敏感性，由此构成一个新的调定点[21]。检测这两类蛋白的变化，就能多方面的了解凋亡信号在细胞内所引起的变化。

本实验用更年平调液给更年期大鼠灌胃，经免疫组织化学方法显示，更年平调液组心肌细胞Bcl-2呈强阳性表达，Bax无表达，表明Bcl-2具有抗心肌细胞凋亡的作用。更年期对照组心肌细胞Bcl-2无表达，Bax呈强阳性表达，表明该组心肌有发生凋亡的趋势。青年对照组心肌细胞Bcl-2呈强阳性表达，Bax无表达，这可能是尚存活的心肌的一种自我保护机制。结果还提示Bcl-2在更年平调液组的表达高于更年期对照组，Bax在更年期对照组的表达高于更年平调液组，差异有统计学意义（P＜0.01）。在更年平调液组，Bcl-2表达占优势，Bax低表达，可以形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚体和少量Bcl-2/Bax异源二聚体，而这两种二聚体存在时起抑制细胞凋亡，维持细胞存活的作用。而Bax在更年期对照组表达增高，致使Bcl-2表达的减少，在更年期对照组Bax表达占优势，形成Bax/Bax同源二聚体增多，诱发细胞凋亡。Bcl-2的表达和Bax的过度表达在人心肌缺血保护或促进心肌细胞凋亡过程中可能具有重要的病理生理作用。Bax蛋白与Bcl-2蛋白共同调节心肌细胞凋亡。

实验结果说明更年平调液对更年期大鼠心肌细胞有保护作用。更年期平调液经多年临床应用已证实能明显改善更年期妇女的心血管症状。中医学认为：心为火，肾为水，水火相济，心肾功能才可以维持平衡，因此可用补肾法来调节心脏功能。更年平调液中肉苁蓉、枸杞子、女贞子和制何首乌具有补益肝肾、调节冲任的功效，龙齿平肝潜阳,镇静安神，诸药合用使肝肾之阴得补，阳亢得抑，其目的是使“阴平阳秘”，以平为度。更年平调液对更年期大鼠心肌细胞的作用是能减少凋亡细胞数，增加成活细胞数，对心肌细胞起了重要的保护作用。

4 结论

更年平调液能抑制心肌细胞凋亡，对心肌细胞起着重要的保护作用。

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Effect of Gengnian Pingtiao liquid on expression of Bcl-2 and Bax in myocardial cell of rats with climacteric

JIANG Bo1,ZHANG Duan-lian2
（1.Department of TCM,The Third Hospital of Wuhan,Wuhan 430061,China; 2.Basic Medical College of Wuhan University,Wuhan 430062,China）

[Objective]To explore of protective effects of Gengnian Pingtiao liquid on myocardial cell of rats with Climacteric.[Methods]The 20 SD rats of 11 to 15 months old with the natural climacteric were randomly divided into two groups:Gengnian Pingtiao liquid group (group P),menopause control group (group M).Another 10 SD rats,4～6 month old were taken for young control group (group Y).After experiment for 45 days,the average optical density(OD)and the rate of positive area of expression of Bcl-2 and Bax were analyzed by image analysis with HPIAS-2000 analysis system.[Results]The expression of Bcl-2 in group P was significantly higher than that in group M(P<0.01).No significant difference of expression of Bcl-2 was found between the group P and that in group Y(P＞0.05). The expression of Bax in group P was significantly lower than that in group M(P<0.01).No significant difference was found in the expression of Bax between group P and that in group Y(P＞0.05).[Conclusion]Gengnian Pingtiao liquid can inhibit the myocardial cell apoptosis and plays an important protective role for myocardial cell.

Gengnian Pingtiao liquid;cardiac muscle;menopause rats;Bcl-2;Bax;apoptosis;immunohistochemistry

R285.5

A

1672-1519（2012）04-0367-05

2012-02-13）

江 波（1968-），女，硕士，副主任医师，副教授，主要研究方向为中西医结合治疗老年病。