骨碎补外用对环磷酰胺致小鼠斑秃模型的影响*

黄云英，张德芹，沈 丽，王雪妮，杜 娟，王元元

（天津中医药大学中医药研究院，方剂学教育部重点实验室，天津 300193）

骨碎补外用对环磷酰胺致小鼠斑秃模型的影响*

黄云英，张德芹，沈 丽，王雪妮，杜 娟，王元元

（天津中医药大学中医药研究院，方剂学教育部重点实验室，天津 300193）

[目的]考察骨碎补外用对环磷酰胺致C57BL/6小鼠斑秃模型的影响。[方法]采用环磷酰胺腹腔注射建立C57BL/6小鼠斑秃模型，观察骨碎补外用对小鼠毛囊组织学变化和血清细胞间黏附蛋白（ICAM-1）、内皮细胞-白细胞黏附分子-1（ELAM-1）水平的影响。[结果]骨碎补外用能使实验性斑秃模型小鼠血清ICAM-1和ELAM-1水平降低，毛囊数增多（P<0.05或P<0.01）。[结论]骨碎补外用能够抑制毛囊进入退行期，对斑秃模型小鼠具有治疗作用。

骨碎补；外用；环磷酰胺；斑秃

骨碎补为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei (Kunze)J.Sm.的干燥根茎。其味苦，性温。归肝、肾经。《本草纲目》中记载骨碎补治病后发落：“胡孙姜（骨碎补）、野蔷薇嫩枝煎汁，刷之。”[1]但其所治“病后发落”与“斑秃”是否有相关性有待深入考证。2010年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）记载骨碎补“外治斑秃”[2]，但相关药理作用研究却仍处于起步阶段，其作用靶点及机制有待于进一步研究。本实验采用环磷酰胺诱导C57BL/6小鼠脱发模型观察骨碎补外用对毛发生长周期和血清中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、内皮细胞-白细胞黏附分子-1（ELAM-1）水平的影响，考察骨碎补外用对斑秃模型动物的治疗作用，为《中国药典》完善骨碎补“外治斑秃”功能提供药效学参考依据。

1 材料与方法

1.1 药物 骨碎补药材购于安徽亳州药材市场，由天津中医药大学生药教研室李天祥老师鉴定，批号为2011032。注射用环磷酰胺，0.2g/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号为11061821，实验前用注射用生理盐水配成所需浓度。2%米诺地尔擦剂为天津市长征医院产品，批号为20110809。ICAM-1试剂盒、ELAM-1试剂盒均为上海蓝基生物科技有限公司产品，批号均为20111114。

1.2 仪器 TD10001电子天平（天津市天马仪器厂），Infinite M200微量多功能读板机（瑞士TECAN公司），BMJ-1生物组织包埋机（天津航空机电公司），RM2135切片机（德国LEICA公司），BX41研究级正置显微镜及成像系统（日本OLYMPUS公司）。

1.3 动物 C57BL/6小鼠，8周龄，雄性，体质量（20±2）g，由北京市华阜康实验动物科技有限公司提供，动物许可证号为SCXK（京）2009-0004。

1.4 方法

1.4.1 骨碎补提取 骨碎补药材550g，粉碎，用60%乙醇回流提取3次，每次1h，回收乙醇至240g。实验前用60%乙醇配成0.69g/g药液。

1.4.2 模型制备 按文献方法[3]，C57BL/6小鼠60只，按随机数字表法随机分为6组，每组10只，即正常对照组、模型对照组、米诺地尔对照组、骨碎补高（2.4g/kg）、中（1.2g/kg）、低（0.6g/kg）剂量组。将小鼠用乙醚轻度麻醉后，用石蜡将其背部毛拔掉，诱导生长期毛囊改变，面积约为3cm×4cm。于拔毛后第9天，除正常对照组给等量生理盐水外，其他各组均腹腔注射环磷酰胺150mg/kg。

1.4.3 给药治疗 从拔毛第2天开始，模型对照组小鼠外涂等体积60%乙醇，米诺地尔对照组外涂2%米诺地尔擦剂0.3mL/只，骨碎补高、中、低剂量组外涂骨碎补醇提液2.4、1.2、0.6g生药/kg，每日给药1次，连续给药18d，定时拍照观察小鼠毛发脱落及生长情况。

1.4.4 指标观察 实验结束后，小鼠摘除眼球取血，注入试管中静置2h，离心（1000 r/min，20min），分离血清，采用双抗体夹心ELISA法测定血清中ICAM-1和ELAM-1水平，操作参照试剂盒说明书。再取小鼠背部皮肤，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片，苏木-伊红素（HE）染色，观察5个不重叠的视野，计算每视野平均毛囊个数。

1.5 统计学分析 采用SPSS18.5统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布计量资料组间比较采用单因素方差分析，偏态分布计量资料组间比较采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 背部拔毛区皮肤颜色变化 C57BL/6小鼠拔毛后第1～4天内，皮肤颜色呈粉红色，未发生明显变化，处于生长期早期；第5～6天，皮肤颜色逐渐变为灰色，进入生长期第V亚期；第10～11天，各组小鼠背部拔毛区皮肤呈黑色并可见新长出的毛发；注射环磷酰胺后4～5d，除正常组外各组小鼠头部和背部毛发开始出现脱落；拔毛后第17～18天，正常对照组新长出的毛发已经覆盖整个脱毛区，其余各组小鼠皮肤颜色开始变浅变灰，为退行性改变。与文献报道一致[4]。

2.2 组织学检查 拔毛后第18天，组织学检查各组小鼠毛囊形态有一定的差异。镜检可见正常鼠处于生长期，皮肤表皮较薄；模型对照组毛囊数目明显减少，毛囊缩短，扭曲，毛囊下段退化，呈营养障碍性，毛囊色素生成障碍，毛囊管膨大，呈退行性改变，此外，可见皮肤表皮明显增生，棘层和颗粒层增厚，细胞层数增多；米诺地尔对照组及骨碎补2.4g/kg剂量组小鼠毛囊数目接近正常鼠，毛囊较大、较长，多数仍为生长期。米诺地尔对照组和骨碎补2.4g/kg剂量组毛囊数与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

2.3 血清ICAM-1和ELAM-1的检测结果 见表2。模型对照组ICAM-1和ELAM-1水平提高，明显高于正常对照组（P<0.05或P<0.01），给药后血清中ICAM-1和ELAM-1水平降低，米诺地尔对照组和骨碎补0.6g/kg剂量组ICAM-1水平与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），骨碎补2.4、1.2、0.6g/kg剂量组ELAM-1水平与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

表1 骨碎补对环磷酰胺诱导斑秃模型小鼠毛囊的影响（±s）Tab.1 Effects of Drynaria fortunei on folliculus pili of alopecia areata mice induced by cyclophosphamide（±s）

表1 骨碎补对环磷酰胺诱导斑秃模型小鼠毛囊的影响（±s）Tab.1 Effects of Drynaria fortunei on folliculus pili of alopecia areata mice induced by cyclophosphamide（±s）

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

组别 剂量（g/kg） 每视野毛囊数（个）正常对照组 54.2±21.0**模型对照组 26.2±7.9米诺地尔对照组 0.3mL/只 44.8±15.3*骨碎补高剂量组 2.4 40.5±18.4*骨碎补中剂量组 1.2 31.4±16.5骨碎补低剂量组 0.6 28.7±12.8

表2 骨碎补对环磷酰胺诱导斑秃模型小鼠血清ICAM-1、ELAM-1的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of Drynaria fortunei on serum ICAM-1 and ELAM-1 in mice with alopecia areata mice（±s，n=10）ng/m L

表2 骨碎补对环磷酰胺诱导斑秃模型小鼠血清ICAM-1、ELAM-1的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of Drynaria fortunei on serum ICAM-1 and ELAM-1 in mice with alopecia areata mice（±s，n=10）ng/m L

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

组别 剂量（g/kg） ICAM-1 ELAM-1正常对照组 1.03±0.22* 1.07±0.21**模型对照组 1.37±0.40 1.53±0.50米诺地尔对照组 0.3mL/只 1.01±0.36* 1.36±0.39骨碎补高剂量组 2.4 1.32±0.23 1.04±0.18**骨碎补中剂量组 1.2 1.17±0.21 1.10±0.20*骨碎补低剂量组 0.6 0.77±0.21** 1.13±0.45*

3 讨论

斑秃是在不可预见的情况下，在不固定区域发生的非创伤性毛发脱落，属于中医“油风”、“鬼剃头”的范畴，但病因至今未明。中医认为，气血不足和失于调达是脱发的主要机制[5]。而现代医学则认为先天性脱发属常染色体隐性遗传或其他缺陷，后天性脱发由某些全身性疾病头部局部疾患及精神因素、遗传、内分泌障碍性疾病、机械性或化学刺激等多种因素造成[6]。其临床表现往往是多种复杂因素相互作用的结果。斑秃的治疗是个世界性的难题，治疗斑秃的药物研究也比较广泛，从目前看主要为一些调节毛囊炎症和促进毛发生长的药物。

毛发生长经历生长期、退行期和休止期的周期性生长，通过皮肤的颜色可以简单地判断毛发周期的变化[7]。C57BL/6小鼠躯干皮肤的黑素细胞只存在于毛囊中，而且仅于生长期时合成黑素并传递给角质形成细胞，使皮肤变为黑色；至退行期，黑素生成减少，皮肤呈灰色；至休止期，黑素合成完全停止，皮肤变为粉红色。此过程受生长因子、细胞因子、激素、神经肽、药物等多种体内外因素调节。

抗肿瘤药物引起的毛发脱落是最常见的生长期秃发，这些药物在消灭迅速分裂的癌细胞的同时，也攻击毛囊四周迅速分裂的细胞，导致脱发[8]。有研究发现[9]，环磷酰胺能够导致毛囊细胞凋亡，并明显提高小鼠血清和局部毛囊内ICAM-1和ELAM-1的水平，其可能通过调节小鼠血清和局部毛囊内ICAM-1和ELAM-1表达水平而产生化疗性脱发。在实验动物中，如果临时可逆性地抑制ICAM-1和ELAM-1表达，可以减轻抗癌治疗中的毒性反应。

本实验采用8周龄的C57BL/6小鼠背部皮肤拔毛，诱导生长期毛囊的产生，然后于拔毛后第9天单剂量腹腔注射环磷酰胺150mg/kg，成功诱导严重的毛发脱落，建立生长期秃发的动物模型，研究骨碎补外用对C57BL/6小鼠毛发生长周期的影响。通过组织学观察到用药组小鼠毛囊数较模型对照组增多，骨碎补外用能够改善毛囊营养，减少退行期毛囊内细胞凋亡，抑制毛囊进入退行期，可见骨碎补外用在一定程度上能够对抗环磷酰胺诱导的毛发脱落。本研究还发现，通过骨碎补治疗后斑秃模型小鼠血清中ICAM-1和ELAM-1水平降低，但其促进毛发生长的作用是否与其能够降低血清中ICAM-1和ELAM-1水平有关，还有待进一步研究。

[1]明·李时珍.本草纲目[M].北京：中医古籍出版社,1994：593.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：239．

[3]Paus R,Handjiski B,Eichmüller S,et al.Chemotherapy-induced alopecia in mice.Induction by cyclophosphamide,inhibition by cyclosporine A,and modulation by dexamethasone[J].Am J Pathol, 1994,144(4):719-734.

[4]Slominski A,Paus R.Melanogenesis is coupled to murine anagen: toward new concepts for the role of melanocytes and the regulation of melanogenesisinhairgrowth[J].JInvestDermatol,1993,101(1Suppl): 90S-97S.

[5]闫秋虹，陈 宏．从气血论脱发[J].天津中医药大学学报，2010，29（4）：175－176．

[6]王惠华.中医药治疗脱发[J].天津中医药大学学报，1995，14（2）：22．

[7]Paus R,Handjiski B,Czarnetzki BM,et al.A murine model for inducing and manipulating hair follicle regression(catagen):effects of dexamethasoneandcyclosporinA[J].JInvest Dermatol,1994,103(2): 143-147.

[8]Jimenez JJ,Roberts SM,Mejia J,et al.Prevention of chemotherapyinduced alopecia in rodent models[J].Cell Stress and Chaperones, 2008,13(1):31-38.

[9]刑 飞，姜 波，涂亚庭．环磷酰胺对小鼠血清和局部毛囊内ICAM-1及ELAM-1水平的影响[J].中国皮肤性病学杂志，2010，24（4）：314－317．

Experimental effects of Drynaria fortunei on alopecia areata induced by cyclophosphamide in mice

HUANG Yun-ying,ZHANG De-qin,SHEN Li,WANG Xue-ni,DU Juan,WANG Yuan-yuan
（Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae,Institute of traditional Chinese medicine, Tianjin University of TCM,Tianjin 300193，China）

[Objective]To investigate the effects of Drynaria fortunei on alopecia areata induced by cyclophosphamide in C57BL/6 mice.[Methods]Severe alopecia was induced by cyclophosphamide in these mice.The hair growth and histological changes were observed in the back skin of them.The levels of ICAM-1 and ELAM-1 in the serum were determined by ELISA.[Results]The levels of ICAM-1 and ELAM-1 in herbal group were lower than that in the control group.The nutrition of hair follicles was also improved.[Conclusions]The extract from Drynaria fortunei has a promoting effect on the hair growth by its external application.

Drynaria fortunei;external application;cyclophosphamide;alopecia areata

R285.5

A

1672-1519（2012）04-0375-03

2012-02-10）

国家科技支撑计划项目（2008BA153B09）。

黄云英（1985-），女，硕士研究生，主要研究方向为中药基本理论及临床应用。

张德芹。