犀黄丸对大肠癌LoVo细胞基质金属蛋白酶2，9蛋白表达的影响*

孙莉娜，孟静岩，王 威，应森林，李 丹，马佐英，贾彦焘

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

犀黄丸对大肠癌LoVo细胞基质金属蛋白酶2，9蛋白表达的影响*

孙莉娜1，孟静岩1，王 威1，应森林1，李 丹1，马佐英1，贾彦焘2

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

[目的]研究犀黄丸含药血清对大肠癌LoVo细胞中基质金属蛋白酶-2,9（MMP-2，MMP-9）表达的影响及意义。[方法]应用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，检测犀黄丸含药血清作用下LoVo细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平。[结果]在犀黄丸含药血清的干预下，LoVo细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白分泌水平与空白对照组比较明显下调，差异具有统计学意义（P<0.05）。[结论]犀黄丸可能通过抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表达，达到抑制大肠癌转移的作用。

LoVo细胞；犀黄丸；含药血清；基质金属蛋白酶-2，9

大肠癌（CRC）是结肠癌和直肠癌的总称，为临床常见的消化道恶性肿瘤之一，居全球恶性肿瘤发病率的第3位。随着人们生活饮食水平的提高，其发病率呈逐年上升状态，严重威胁着人类的健康。目前，手术仍为主要治疗方法，但其根治性手术切除后5 a生存率仅为50%左右[1]，术后复发和转移是导致患者死亡的重要原因。因此，深入研究和探讨大肠癌转移相关机制具有非常重要的意义。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌离子依赖性内肽酶，能降解细胞外基质中的多种蛋白质成分，是血管新生的重要环节[2]，在肿瘤的浸润和转移中占据重要地位，其中以MMP-2、MMP-9最为关键[3]。研究发现，结直肠癌中MMP-2、MMP-9呈现过表达，在结直肠癌的转移进展中起重要作用，且MMP-2蛋白表达能作为结直肠癌淋巴结转移的独立预测指标[4]。

犀黄丸又名西黄丸，载于清·王维徳所著《外科证治全生集·卷四》，由牛黄、麝香、乳香、没药4味组成，具有清热解毒、消痰软坚、化瘀散结、消肿止痛之功[5]。实验药理学和临床研究均提示，犀黄丸对各种肿瘤具有一定的治疗作用，其抗癌谱广且毒副作用小，是临床上广泛应用的抗肿瘤药之一[6]。本实验通过体外细胞培养，采用血清药理学方法，研究犀黄丸干预大肠癌高转移细胞株 LoVo细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达情况，探讨犀黄丸干预大肠癌转移可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验药品及主要试剂 犀黄丸为天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂生产。MMP-2，MMP-9酶联免疫检测试剂盒均为美国R&D公司产品，F12K培养基（北京迈晨科技有限公司），胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries），胰蛋白酶（美国Sigma公司），磷酸盐缓冲液（PBS，北京中杉金桥生物技术有限公司）,青霉素、链霉素均为国产市售产品。

1.2 实验动物和细胞 Wistar大鼠24只，体质量（210±10）g，雄性，购自天津市山川红实验动物科技有限公司，许可证号：SGXK（津）2009-0001。人大肠癌LoVo细胞株，购于美国典型培养物保藏中心（ATCC），用含有10%FBS的F12K培养基培养。

1.3 含药血清制备 Wistar大鼠药物组采用前期细胞增殖抑制实验结果最佳的相对高剂量用药组（6倍7d组和6倍14d组）即以犀黄丸临床6倍剂量换算为大鼠剂量3.24g/（kg·d），给予犀黄丸混悬液，每日2次，每次2mL，进行灌胃。设立相应空白对照组（空白7d、空白14d组），给予等剂量生理盐水。按要求分别灌胃7、14d，末次给药1h后，乙醚麻醉股动脉取血，分离血清，56℃、灭活30min，过滤除菌、分装，-80℃保存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养上清液的制备 10%FBS的F12K培养液、对数生长期的LoVo细胞，制成单细胞悬液。4.5×104个细胞/（mL·孔），接种于24孔培养板中，于5%CO2，37℃，饱和湿度的培养箱中培养24h后，10%含药血清的F12K培养液作用48h，每组设3个复孔。收集培养上清液，分装，冻存于-20℃中备用。使用前12 000g离心5min，取上清液即可检测。

1.4.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测MMP-2、MMP-9 采用由美国R&D公司生产的MMP-2、MMP-9酶联免疫检测试剂盒，严格按照说明书进行操作。用多功能微孔板分析仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。绘制标准曲线，依据吸光度值，计算样品相应蛋白浓度。

1.5 统计方法 所得数据采用SPSS18.0进行统计，用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

检测结果显示，人大肠癌LoVo细胞培养上清中，MMP-2、MMP-9蛋白在各组均有表达。药物组MMP-2、MMP-9表达水平与各自空白对照组相比均有所下降；6倍7d组中MMP-2表达与其空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05，见表1），6倍14d组与其空白对照组比较差异无统计学意义（P> 0.05）；6倍7d组和6倍14d组中MMP-9与各自空白对照组相比表达水平均表现显著降低的趋势（P<0.01，见表2）。两空白对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

细胞外基质和基底膜是肿瘤生长、扩散的自然屏障，癌细胞对细胞外基质（ECM）的降解是癌症转移过程中的重要步骤。肿瘤细胞对细胞外基质的降解作用是通过产生或诱导产生蛋白酶类实现的[7]。MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成员，实验证实，随着肿瘤TNM分期的增高、淋巴结转移的发生，MMP-2、MMP-9的表达逐渐增高，肿瘤降解ECM基底膜的能力增强，侵袭性增加，发生转移的可能性也增大[8]。已有大量研究发现，MMP-2和MMP-9的表达水平与胃癌、卵巢癌、肺癌、大肠癌等多种恶性肿瘤的发生、侵袭及淋巴结转移密切相关[9]。

表1 犀黄丸含药血清对LoVo细胞MMP-2的影响（±s）Tab.1 Effect of Xihuang pills on the MMP-2 in LoVo cells（±s）

表1 犀黄丸含药血清对LoVo细胞MMP-2的影响（±s）Tab.1 Effect of Xihuang pills on the MMP-2 in LoVo cells（±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

组别 A450 nm OD值 MMP-2浓度（μg/mL）6倍7d组 1.049±0.039 0.721±0.034*空白7d组 1.145±0.021 0.803±0.0186倍14d组 1.076±0.070 0.744±0.061空白14d组 1.130±0.071 0.791±0.062

表2 犀黄丸含药血清对LoVo细胞MMP-9的影响（±s）Tab.2 Effect of Xihuang pills on the MMP-9 in LoVo cells（±s）

表2 犀黄丸含药血清对LoVo细胞MMP-9的影响（±s）Tab.2 Effect of Xihuang pills on the MMP-9 in LoVo cells（±s）

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

犀黄丸是治疗乳岩、瘰疬、痰核、肺痈等的名方，方中牛黄芳香性寒，能清热解毒，豁痰开窍，消肿止痛，辅以麝香辛通走窜，能通行十二经脉，具有开窍醒神，活血化瘀，消肿止痛之功。佐药乳香、没药为常用药对，合用可通经疏络，活血行气，消肿止痛。此方为清热解毒，活血祛瘀，软坚消肿之上品。现代药理研究表明，犀黄丸可以起到抗炎，镇痛，止血消肿和抗癌等作用。实验发现，牛黄能够诱导肿瘤细胞的凋亡，以牛黄为主的中药组方能明显提高机体的免疫功能，减轻化疗的毒副作用且不影响肿瘤对化疗的反应[10]；麝香具有抑制肿瘤细胞生长、诱导癌细胞凋亡和影响癌基因、抑癌基因的表达[11]；乳香没药能抑制肿瘤细胞增殖并具有抗炎镇痛的作用[12]。

本实验应用血清药理学方法，用犀黄丸含药血清作用于人大肠癌LoVo细胞后，细胞上清液中的MMP-2和MMP-9的活性蛋白表达量下降，提示犀黄丸能够降低LoVo细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平，可能是犀黄丸能够抑制大肠癌转移的作用机制之一。由于中药含药血清成分复杂，中药复方在机体内循环起作用的机制尚在探索阶段，因此犀黄丸含药血清降低MMP-2及MMP-9蛋白表达水平的明确机制尚有待于进一步探讨和研究。

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[3]何 苗，傅仲学.DDR1a在结肠癌细胞株中的表达及与基质金属蛋白酶2，9的关系[J].重庆医科大学学报，2009，34（2）：161－163．

[4]马新学，范青松，肖国富.组织微阵列检测结直肠癌组织中MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白的表达[J].诊断病理学杂志，2009，16（3）：188－191．

[5]韩 涛，程志强，兰咏梅，等．西黄丸抗乳腺增生作用的实验研究[J].中药药理与临床，2009，25（5）：15－16．

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Effect of Xihuang pills on protein expressions of MMP-2 and MMP-9 in human colorectal carcinoma LoVo cell

SUN Li-na1,MENG Jing-yan1,WANG Wei1,YING Sen-lin1,LI Dan1,MA Zuo-ying1,JIA Yan-tao2
（1.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China; 2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the effect of Xihuang pills(medicine-contained serum)on the protein expressions of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in human colorectal carcinoma LoVo cell.[Methods]The enzyme-linked immunoassay(ELISA)was used to determine the expression of MMP-2 and MMP-9 in the culture solution of LoVo cell under the action of Xihuang pills.[Results]The expression of MMP-2 and MMP-9 in medication groups was significantly lower than those of control group (P<0.05).[Conclusion]Xihuang pill has a potent effect of reducing the expressions of MMP-2 and MMP-9.This mechanism may play an important role in the suppression of colorectal carcinoma metastasis.

LoVo cell；Xihuang pills；medicine-contained serum；matrix metalloproteinase-2,9

R285.5

A

1672-2-5 （2012）04-0378-03

2012-05-04）

国家自然科学基金项目（3087227）。

孙莉娜（1983-），女，2009级硕士研究生，主要从事中医基础理论及脾胃病中医药诊疗方法研究。

孟静岩。