杜仲不同提取部位对离体血管舒张作用的研究*

王 虹，瞿晶田，赵 鑫，郭 英，刘二伟

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 300193；2.天津中医药大学，天津市中药药理学重点实验室，天津 300193）

杜仲不同提取部位对离体血管舒张作用的研究*

王 虹1，2，瞿晶田1，赵 鑫2，郭 英2，刘二伟1

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 300193；2.天津中医药大学，天津市中药药理学重点实验室，天津 300193）

[目的]寻找杜仲中具有血管舒张作用的提取部位。[方法]分离得到杜仲11个提取部位，采用大鼠胸主动脉环实验观察各提取部位的血管舒张作用。[结果]在11个组分中只有组分6和11（终浓度0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mg/mL）可浓度依赖性舒张去甲肾上腺素收缩的离体血管。[结论]杜仲提取部位6和11富含杜仲中舒张血管的有效成分。

杜仲；提取部位；血管舒张

杜仲为杜仲科植物杜仲 Eucommia ulmoides Oliv.的树皮，是名贵滋补药材，具有补肝肾，强筋骨，安胎，降压之功效，在临床上应用于治疗肝肾不足、腰膝酸痛、高血压等[1]。杜仲降压的作用一直是人们研究的热点。血管舒张可以使总外周阻力下降，血压进而降低。已经有研究证实，杜仲水提物具有血管舒张的作用[2-3]，然而水提物质量可控性差，影响疗效。因此应用现代的分离方法，在粗提物中寻找药效化学物质基本清楚、质量可控的杜仲提取部位或组分，对于提高杜仲降压疗效以及开发治疗相关疾病的药物具有重要意义。因此，本研究通过体外大鼠胸主动脉环实验模型，对杜仲11个不同的提取部位进行研究，以期寻找杜仲中具有良好血管舒张作用的部位或组分。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Wistar大鼠，雄性，体质量250～300g，购自中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心。

1.2 杜仲不同提取部位的制备方法 将500g药材加水置于10 L圆底烧瓶中以煎煮法回流提取2h，以纱布过滤，收集提取液。药渣重新以8倍量溶剂再次回流提取2h，过滤后收集提取液。合并两次

提取液进行减压蒸馏，将提取液浓缩至850mL左右。量取50mL提取液浓缩后干燥得样品（1），其余800mL提取液进行后续处理。

其余800mL提取液加入95%乙醇约2250mL进行醇沉淀（最终醇浓度70%），充分搅拌后静置30min。所得混悬物经离心（4000 r/min，离心10min）后得沉淀，沉淀真空干燥后记作样品（2），上清液减压蒸馏除去乙醇后浓缩至550mL，量取50mL蒸干并真空干燥得样品（3），其余500mL进行后续操作。

醇沉后溶液分别以等量石油醚、乙酸乙酯萃取3次，分别合并提取液，得到石油醚萃取样品（4）、石油醚萃取母液样品（5）及乙酸乙酯萃取样品（6）、乙酸乙酯萃取母液样品（7）。石油醚萃取母液样品（5）、乙酸乙酯萃取母液样品（7）分别取50mL真空干燥得样品（5）、（7），石油醚萃取样品（4）、乙酸乙酯萃取样品（6），浓缩后干燥得样品(4)、(6)。

称取400g大孔树脂制成大孔吸附树脂色谱柱，将乙酸乙酯萃取后母液（7）溶液上样完毕后静置4h使树脂柱充分吸附，分别以水、20%、70%、95%乙醇梯度洗脱，洗脱剂分别为2倍柱体积约1200mL，收集洗脱液分别蒸干后真空干燥得到样品（8）、（9）、（10）、（11）。

1.3 主要试剂 去甲肾上腺素（NE），乙酰胆碱（ACH）（美国Sigma公司），氯化钠（NaCl），氯化钾（KCl），磷酸二氢钾（KH2PO4），七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O），碳酸氢钠（NaHCO3），葡萄糖（C6H12O6），氯化钙（CaCl2）（天津市北方天医化学试剂厂）。

1.4 实验仪器 Maclab AID生物记录软件（澳大利亚Powerlab公司），Radnoti组织器官灌流系统（美国Powerlab公司）。

1.5 实验方法 参照文献[4-5]进行。断头处死大鼠，迅速开胸，分离剪取胸主动脉，置于预冷的Krebs液中，小心去除血管周围结缔组织，剪成3～4 mm的血管环。若去内皮，用玻璃棒轻轻碾压血管。将处理好的动脉环一端固定于洗浴槽，另一端连接张力换能器，动脉环应处于松弛状态，固定好后调整动脉环张力至0.5g，置于不断充入95%O2和5%CO2混合气体的10mL的Krebs液中，水浴温度为37℃，持续15min。换液，基线上调0.5g，持续15min，再换液，再上调，直至动脉环张力到2.0g。动脉环稳定不小于90min，待稳定后正式实验。

首先加入高钾母液使钾离子终浓度达到60 mmol/L，刺激血管收缩（8～10min），换液，加入10mL的Krebs液，平衡到2.0g(15min)。加入NE（终浓度10-6mol/L）刺激血管收缩（8min），然后加入ACH（终浓度为10-5mol/L）作用8min，证明血管内皮是否存在，换液，加入10mL的Krebs液，平衡到2.0g(15min)。加入NE（终浓度10-6mol/L）刺激血管收缩（8min），然后加入受试药物（各作用时间为8min），记录血管张力曲线。

1.6 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 杜仲不同提取部位固形物收率 杜仲不同提取部位固形物收率见表1。

表1 固形物收率Table 1 The recovery rate

2.2 组分6对离体血管的舒张作用 组分6（0．4、0．8、1．2、1．6、2．0mg/mL）可浓度依赖性舒张去甲肾上腺素收缩的离体血管，累积加入组分6后血管的收缩率与空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0．01），见图1和表2。

表2 组分6对去甲肾上腺素收缩的离体大鼠胸主动脉的舒张作用（±s）Tab.2 Vasorelaxation effect of constituents 6 in aortic rings precontracted with norepinephrine（±s）

表2 组分6对去甲肾上腺素收缩的离体大鼠胸主动脉的舒张作用（±s）Tab.2 Vasorelaxation effect of constituents 6 in aortic rings precontracted with norepinephrine（±s）

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

收缩率（%）0.4mg/m L组分6 0.8mg/m L组分6 1.2mg/m L组分6 1.6mg/m L组分6 2.0mg/m L组分6空白对照组 6 106.32±2.51 115.32±7.99 112.36±10.78 102.83±11.48 90.48±14.38加药组 4 96.52±2.02** 89.63±2.06** 79.78±3.16** 70.92±4.61** 59.72±9.34**组别 n

2.3 组分11对离体血管的舒张作用 组分11（0．4、0．8、1．2、1．6、2．0mg/mL）可浓度依赖性舒张去甲肾上腺素（NE）收缩的离体血管，累积加入组分11后血管的收缩率与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0．01），见图2和表3。

3 讨论

杜仲的化学成分研究已有大量报道，现代药理学研究发现杜仲中降压成分大致分为4类：木脂素类、苯丙素类、环烯醚萜类、黄酮类。这些成分通过作用于不同的靶点共同发挥降压的作用[6]。因此发挥中药多成分协同作用的优势，寻找杜仲中具有良好降压作用的部位和组分极具应用价值。

表3 组分11对去甲肾上腺素收缩的离体大鼠胸主动脉的舒张作用（±s）Tab.3 Vasodilation effect of constituents 11 in aortic rings contracted with norepinephrine（±s）

表3 组分11对去甲肾上腺素收缩的离体大鼠胸主动脉的舒张作用（±s）Tab.3 Vasodilation effect of constituents 11 in aortic rings contracted with norepinephrine（±s）

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

收缩率（%）0.4mg/m L组分11 0.8mg/m L组分11 1.2mg/m L组分11 1.6mg/m L组分11 2.0mg/m L组分11空白对照组 6 106.32±2.51 115.32±7.99 112.36±10.78 102.83±11.48 90.48±14.38加药组 4 96.58±4.41** 91.10±4.05** 77.99±2.74** 66.97±4.00** 51.10±6.37**组别 n

本研究对杜仲水煎液通过不同处理方法得到11个不同的提取部位，采用大鼠胸主动脉环实验观察其舒张血管作用。NE是强α受体激动剂，激活血管平滑肌细胞α受体以后，一方面开放受体操纵性钙通道，促使细胞外钙内流，另一方面通过激活IP3信号通路释放细胞内钙，两者共同促发细胞的收缩效应。研究结果表明，在杜仲的11个提取部位中，提取部位6和提取部位11可浓度依赖性地舒张NE预收缩的血管环，显示出较好的血管舒张作用，而其余提取部位作用不明显，提示此两个部位富集了杜仲中直接作用于血管细胞的降压成分。

在以后的研究工作中，笔者将以上述两种组分为研究对象，对其化学成分进行系统分离，建立定性和定量的质量控制标准，并且对其发挥作用的机制和药代动力学等进行深入的研究，为中药的现代化提供理论依据。

[1]高学敏.中药学[M].北京：中国中医药出版社，2002:520-521.

[2]Kwan CY,Chen CX,Ddyama T,et al.Endothelium dependent vasorelaxant effects of the aquenous extracts of the Eucommia ulmoidesn Oliv.leaf and bark:imp lications on their antihypertensive action[J].Vascul Pharmacology,2003,40(5):229-235.

[3]Kwan CY,Zhang WB,Deyama T,et al.End thelium dependent vascular relaxation induced by Eucommia ulmoides Oliv.bark extract is mediated by NO and EDHF in small vessels[J].Naunyn Schmied ebergs Arch Pharmacol,2004,369(2):206-211.

[4]Tep-areenan P,Sawasdee P,Randall M.Possible Mechanisms of Vasorelaxation for 5,7-Dimethoxyflavone from Kaempferia parviflora in the Rat Aorta[J].Phytother.Res,2010,24:1520-1525.

[5]Xue YL,Shi HX,Muradd,et al.2011.Vasodilatory effects of cinnamaldehyde and its mechanism of action in the rat aorta[J].Vascular Health and Risk Management,2011,7:273-280.

[6]罗丽芳，吴卫华，欧阳冬生，等．杜仲的降压成分及降压机制[J].中草药，2006，37（1）：150－152．

Effects of fractions at different part of Eucommia ulmoides on the vascular relaxation in vitro

WANG Hong1,2,QU Jing-tian1,ZHAO Xin2,GUO Ying2,LIU Er-wei1
（1.Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Chinese Medical Pharmacology,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To find out the fraction of Eucommia ulmoides possessing the best effect of vascular relaxation[Methods]The aortic ring of rats was used as the experiment model to investigate the vascular relaxation effect of different fractions in Eucommia ulmoides.[Result]The fraction 6 and 11(final concentration 0.4,0.8,1.2,1.6,2.0mg/mL)showed a good vasodilation effect in aortic rings precontracted with norepinephrine.[Conclusion]Fraction 6 and 11 enrich the constituents which has good vasodilation effect in Eucommia ulmoides.

Eucommia ulmoides;constituents;vasodilation

R285.5

A

1672-1519（2012）04-0381-03

2012-03-28）

天津市应用基础及前沿技术研究计划项目（11JC ZDJC21100）；国家自然科学基金面上项目（81173592）。

王 虹（1974－），女，博士，副研究员，硕士研究生导师，主要从事中医药防治心脑血管疾病的研究。

王 虹。