针刺内关穴对急性心肌缺血大鼠缺血心肌基因表达谱的影响*

梁宪如，席 强，李晓梅，崔 瑞，金 光，郭 义，郭永明

（1.中国人民武装警察部队后勤学院附属医院，天津 300162；2.天津中医药大学，天津 300193）

针刺内关穴对急性心肌缺血大鼠缺血心肌基因表达谱的影响*

梁宪如1，席 强2，李晓梅2，崔 瑞2，金 光2，郭 义2，郭永明2

（1.中国人民武装警察部队后勤学院附属医院，天津 300162；2.天津中医药大学，天津 300193）

[目的]研究针刺对急性心肌缺血大鼠缺血心肌基因表达谱的影响。[方法]建立左前降支冠状动脉结扎大鼠心肌缺血模型，分组干预后分离提取缺血心肌总RNA，与大鼠全基因表达谱芯片杂交后进行检测，对筛选得到的针刺治疗过程中的差异表达基因，利用基因功能分类体系寻找和分析显著富集差异表达基因的复合功能分类，从基因功能水平探索针刺对急性心肌缺血模型大鼠缺血心肌基因表达谱的影响。[结果]发现心肌缺血24h后表达上调的398条基因中，经过间断针刺内关穴3次，24h后其中298条基因（占表达上调基因的74.87%）的表达出现不同程度的下调趋势；心肌缺血24h后表达下调的338条基因中，经过间断针刺内关穴3次，24h后其中188条基因（占总下调基因的55.62%）的表达出现不同程度的上调趋势，表明针刺内关穴对缺血心肌差异表达基因有良性调节趋势。针对筛选出来的差异表达基因蛋白磷酸酶1B（Ppm1b）、琥珀酸辅酶A连接酶（Suclg1）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶2（Got2）、苹果酸脱氢酶（Mdhl）、丙酮酸脱氢酶磷酸酶同工酶（PDP1）、延胡索酸水合酶（Fh）、羟肽酶b2（Cpb2）、酪氨酸单氧化酶激活蛋白酶（Ywhaz）、S100钙结合蛋白a9（S100A9）、Na+/K+转运ATP酶B1亚基（Atp1b1）、肌钙蛋白I（TnI）、肌球蛋白轻链激酶3（Myl3）、肌集钙蛋白2（Casq2）、肌红蛋白（Mb），其功能模块主要涉及氧化磷酸化、线粒体电子传递、电子传递偶联三磷酸腺苷（ATP）合成、能量代谢、磷酸盐代谢过程、单价无机阳离子转运、辅酶代谢过程等。[结论]针刺内关穴可能是通过影响上述基因，从而对急性心肌缺血发挥保护作用。

针刺；急性心肌缺血；基因功能表达

针刺作为一种有效的治疗手段临床治疗缺血性心脏病取得了较好的疗效，对针刺改善心肌缺血的作用机制也进行了深入研究，但大多研究集中于神经生理学、生物化学、免疫学及内分泌学等研究领域[1]。针刺作为一种非特异的独特疗法，具有多通路、多靶点及多效应的作用特点，既然一切生命现象的产生均依赖于分子的活动及伴随的相应基因转录与调控的变化，而针刺对心肌缺血又具有确切疗效，那么针刺在分子水平究竟能够发挥什么样的作用、通过哪些途径发挥作用、对那些基因的表达与调控具有干预效应呢？本实验通过结扎冠状动脉左前降支的方法造成大鼠心肌缺血模型，采用基因芯片技术对缺血心肌差异表达的基因进行筛选，同时观察针刺内关穴对缺血心肌差异表达基因的干预作用，从基因水平探讨针刺内关治疗心肌缺血的作用机制，为临床针刺治疗该病提供依据。

1 材料与方法

1.1 对象 选择Wistar大鼠，体质量250～300g，2～ 3月龄。

主要仪器和试剂：MP-150生理记录仪，由天津中医药大学实验针灸学研究中心提供。RNA抽提试剂Trizol、大鼠BiostarR-40s表达谱基因芯片（含4096个靶基因）、探针标记杂交试剂盒、ScanArray 4000芯片扫描仪，均由上海博星基因芯片公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验模型的制备、分组和干预 参照《药理实验方法学》[2]，结扎冠状动脉左前降支复制心肌缺血模型，模型复制前采用MP-150生理记录仪描记心电图，心电图异常者去除，并通过心电图确定造模成功。选择模型复制成功的Wistar大鼠30只，按随机数字表法随机分为3组，假手术组，编号为A组（假手术组除不结扎冠状动脉左前降支外，其余手术步骤与模型组相同）；心肌缺血24h组，编号为B组；心肌缺血24h针刺治疗组，编号为C组；每组10只。

以《实验针灸学》[3]的穴位定位为依据，选取大鼠双侧内关穴，24h针刺治疗组于造模后即刻针刺内关穴，行平补平泻法3min，12h后再针刺1次，24h后处死动物，处死前再针刺蓄积1次；假手术组、心肌缺血24h组每日同样抓取，不做处理。

各组动物在造模24h后断头处死，打开胸腔，迅速摘取心脏，剔除其他组织，在RNase-free的生理盐水中迅速漂洗以去除血渍和污物，用冷冻保存管装载，迅速投入液氮冷冻，备检。同组标本混合采用一步法以Trizol试剂分别提取淋巴细胞总RNA，采用Oligotex mRNA Midi Kit提取纯化mRNA。取各组动物心肌细胞的RNA，参照Schena的方法逆转录标记cDNA探针并纯化[4]。用Cy3-dUTP标记A组心肌细胞（绿色荧光），用Cy5－dUTP标记B组和C组心肌细胞（红色荧光）。表达谱探针制备之后进行芯片杂交及洗涤。

1.2.2 观察指标和分析方法 主要观察指标：提取各组总RNA的结果及基因芯片杂交的结果。

分析方法：对芯片行荧光扫描和结果分析。以40个管家基因对原始数据进行标化处理，分析Cy3、Cy5荧光信号强度，计算Cy5/Cy3值。基因差异表达的判定标准：1）该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于800。2）Cy5/Cy3信号比值Ratio>2.0或<0.5（两者信号值相差2倍以上，Ratio值超出2.0或少于0.5越多表示差异越明显）。

对差异表达基因生物信息做GeneOntology分析。

2 结果

2.1 造模前后实验动物心电图变化 见图1、图2。

从图1、图2可以看出，造模前描记的实验动物心电图为正常心电图，结扎冠状动脉左前降支后即刻描记的心电图显示ST段弓背样抬高，呈典型的急性心肌梗死样改变，说明造模成功。

2.2 总RNA提取结果 见图3。各组心肌细胞总RNA经电泳质检，从图3总RNA电泳图谱中可以看出，总RNA电泳图谱有清晰的28 S、18 S条带，且经70℃水浴保温1h后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异，说明抽提的总RNA符合实验要求。

2.3 基因芯片杂交结果

2.3.1 芯片的质量控制标准 实验管家基因、空白对照、阴性对照、梯度对照均阴性。A/B组、A/C组芯片均一化系数分别为1.128、0.979，对照组、实验组扫描图的平均信号强度与平均背景的比值均不小于3，符合表达谱芯片实验成功标准。

2.3.2 各组动物芯片双色荧光标记叠加图 见图4、图5。

图4、图5表示，对于某一点的两种叠加荧光信号，如果Cy3信号较强，该点多显绿色，说明该基因的表达呈下调趋势；如果Cy5信号较强，该点多显红色，说明该基因表达呈上调趋势；如果强度相似，即显黄色，说明该基因的表达未发生明显变化。

2.3.3 各组动物基因芯片杂交信号强度散点图 见图6、图7。

图6、图7中，X轴、Y轴分别以Cy3荧光强度值（＝前景值－背景值）和Cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号；数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5～2.0之间，基本属非差异表达；数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5～2.0范围之外，该点为差异表达基因。

2.3.4 针刺对缺血心肌24h差异表达基因的干预作用 见图8、图9。

比较缺血24h样品B与假手术A比值RatioB和缺血24h针刺样品C与假手术A比值RatioC的比值。

B与A的上调基因共398个，其中有298个基因在RatioC相对于RatioB有明显的下调趋势，下调超过了0.77倍（见图8a）。其他的基因则变化很小（见图8b）。

心肌缺血24h后表达上调的398条基因中，经过间断针刺内关穴3次，24h后其中298条基因（占表达上调基因的74.87%）的表达出现不同程度的下调趋势，表明针刺内关穴对缺血心肌表达上调的大多数基因起到良性调节作用。

B与A的下调基因共338个，其中有188个基因在RatioC相对于RatioB有明显的上调趋势，上调超过了1.3倍（见图9a）。其他的基因则变化很小（见图9b）。

心肌缺血24h后表达下调的338条基因中，经过间断针刺内关穴3次，24h后其中188条基因（占总下调基因的55.62%）的表达出现不同程度的上调趋势，表明针刺内关穴对缺血心肌表达下调的多数基因起到良性调节作用。

2.3.5 针刺调节缺血心肌24h差异表达基因的生物学功能 见表1、表2。

将分析中得到的24h缺血模型针刺前后比值大于1.3倍的差异基因做Gene Ontology分析。统计每个GO term中所包括的差异基因个数，并用统计检验的方法计算每个GO term中差异基因富集的显著性。根据P value大小判断差异基因中具有显著性意义的GO term，从而判断24h缺血模型在针刺前后差异基因的主要生物学功能，见表1。通过文献证实进一步在这些功能分类中发现了可能与针刺有效干预缺血心肌相关的显著差异表达基因，见表2，并将进一步分析这些基因表达的变化与心肌缺血的关系。

表1 显著富集差异表达基因的相关功能分析Tab.1 Correlated functional analysis of significant enriching differential expression gene

针刺调节缺血心肌24h的差异表达基因功能涉及氧化磷酸化、线粒体电子传递、电子传递偶联ATP合成、能量代谢、磷酸盐代谢过程、单价无机阳离子转运、辅酶代谢过程等，显著差异基因主要集中在氧化磷酸化及三羧酸循环过程中的酶，包括蛋白磷酸酶1B（Ppm1b）、琥珀酸辅酶A连接酶（Suclg1）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶2（Got2）、苹果酸脱氢酶（Mdhl）、丙酮酸脱氢酶磷酸酶同工酶（PDP1）、延胡索酸水合酶（Fh）、羟肽酶b2（Cpb2）及酪氨酸单氧化酶激活蛋白酶（Ywhaz）。针刺内关穴主要通过干预缺血心肌能量代谢发挥调节作用。

表2 与针刺相关的显著差异基因及表达倍数Tab.2 Acupuncture related significant differential gene and its expression folds

3 讨论

心肌缺血是引发缺血性心脏病的关键病理环节，严重影响人类的生命健康，临床和实验研究发现心肌缺血伴随着一系列分子水平的变化，心肌缺血前后心肌组织基因表达也有明显的变化，尤其是在缺血心肌区的基因变化对心肌缺血的治疗有着较深远的意义，对这些变化基因进行研究也是阐明心肌缺血分子机制的一种可行途径。

心肌缺血、缺氧时，由于脂肪酸氧化障碍和糖酵解过程限速酶如磷酸果糖激酶等被激活，致使糖酵解增强。缺血时，约有80%的能量是靠酵解过程提供的，故本过程的增强是缺血心肌重要的代偿性应激改变，但该过程的增强可引起乳酸和H+的迅速蓄积而发生中毒，从而抑制其限速酶使酵解过程抑制，结果又会使缺血心肌产能途径阻断。此外急性心肌缺血时，交感-儿茶酚胺系统兴奋，使脂肪分解加强，脂肪酸氧化障碍，从而导致游离脂肪酸（FFA）和酯酰辅酶（Co）A在心肌中蓄积。这些长链脂肪酸不但可与K+、Na+和Ca2+等阳离子结合形成“皂”类化合物，对生物膜的脂类结构起着严重的“去污”破坏作用，并可抑制线粒体的氧化磷酸化和腺苷转移酶的活性，从而影响ATP的产生和运出，此外，还可抑制参与三羧酸循环的酶如柠檬酸合成酶的活性而破坏三羧酸循环[5]。由于对大鼠基因的命名、定位及功能等的研究较少，其中部分基为未知基因，而在已知的部分差异表达基因中，心肌缺血后主要为编码能量代谢过程中的一些酶及辅酶的基因，如：Ppm1b、Ywhaz、Got2、Mdhl、PDP1、Fh、Cpb2、Suclg1，通过上调或下调上述基因表达从而达到保护心肌细胞的目的，这就表明针刺主要通过调节能量代谢过程中的诸多环节从而达到治疗心肌缺血的作用。林亚平等[6]观察电针“内关”对心肌缺血再灌注损伤家兔心肌组织中ATP及其他腺苷酸的影响，发现电针内关和足三里可明显减轻ATP的降低状态，且其分解产物单磷酸腺苷（AMP）增加，AMP在酶的催化下可产生大量腺苷，腺苷可扩张小血管，改善心肌的血流供应，保证了心肌缺血时的能量供给，从而减轻心肌细胞损伤。田岳凤等[7]观察针刺对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞能量代谢物质ATP、AMP和二磷酸腺苷（ADP）变化的影响，结果显示针刺手厥阴心包经穴可明显改变ATP、AMP、ADP的含量，保护心肌的有氧代谢，降低氧自由基的产生，从而有效地保护心肌细胞。上述实验结果与本实验观察结果一致，说明能量代谢环节是针刺治疗心肌缺血关键作用靶点之一。

除能量代谢靶点外，尚发现了某些基因（S100A9、Atp1b1、TnI、Myl3、Casq2、Mb）参与针刺调节缺血心肌作用。S100钙离子结合蛋白是一种钙离子结合蛋白，可以由中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞以及某些上皮细胞合成，在炎性组织中表达上调，具有抗病原微生物功能和趋化活性，而且在炎性反应时S100A8的活性同源二聚体可以被次氯酸盐氧化成非活性的同源二聚体，一方面可限制白细胞的进一步浸润，另一方面可保护细胞免受过度氧化损伤。S100钙离子结合蛋白A9可形成同源二聚体或与S100A8结合形成异源二聚体而发挥抗氧化作用。心肌缺血24h S100A9表达明显增加，针刺内关穴后，S100A9表达下降，可能同样发挥调控炎性反应和抗氧化作用，从而减轻心肌损伤。

钠离子/钾离子-三磷酸腺苷（Na+/K+-ATP）酶是一种广泛存在于真核生物细胞上的跨膜转运蛋白，主要调节细胞内外Na+、K+平衡，维持细胞的容积和保证细胞内环境的稳定。其主要由α和β亚基构成，β亚基是调控α亚基活性的主要成分。Atp1b1可调节Na+-K+-ATP酶活性。β1亚基基因表达减少，进而使Na+-K+-ATP酶活性受抑，使Na+/K+转运减弱，细胞内Na+水平增高，促使钠离子/钙离子（Na+/Ca2+）交换增加，引起细胞内Ca2+水平增加。与此同时，Na+-K+-ATP酶活性受抑又继而进一步抑制肌浆网Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，使肌浆网对Ca2+再摄取的能力降低，从而导致线粒体内Ca2+超载而损伤心肌细胞。针刺内关穴可能通过调节缺血心肌过度表达的Atp1b1，从而减轻心肌损伤。

肌钙蛋白是组成横纹肌细丝的结构蛋白，可调节钙介导的肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互反应，其中TnI是肌原纤维ATP酶的抑制单位，可抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，阻止肌肉收缩；肌球蛋白轻链激酶（Myl3），是一种钙调素（CaM）依赖酶，催化肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化,使肌动球蛋白得以激活肌球蛋白ATP酶，从而引起平滑肌的收缩活动；Casq2肌钙蛋白是一个高通量，具有中度亲和力的钙结合蛋白，因此可充当肌肉的内部钙库，释放的钙通过钙释放通道上行至肌集钙蛋白，触发肌肉收缩；Mb作为氧的供应储备，促进肌肉中氧的代谢。针刺内关穴后上述相关基因表达上调，从而恢复心肌正常能量代谢及增强心肌收缩能力。

针刺作用具有多通路、多靶点及多效应的特点，目前通过差异基因的生物信息学分析提示能量代谢是针刺治疗心肌缺血的关键作用靶点，同时也涉及调控炎症、抗氧化、离子转运、肌肉收缩等多个环节，但是关键差异基因的进一步筛选及验证将更有助于阐明针刺治疗心肌缺血的分子机制及寻找临床治疗新方法，这部分内容有待于进一步开展。

[1]沈 宁，姜海英，曲 丽，等.针刺内关穴抗心肌缺血机制的研究进展[J].黑龙江中医药，2009，38（1）：43－45.

[2]徐淑云，卞如镰，陈 修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，2002.

[3]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003.

[4]Schena M,Shalond,Heller R,et al.Parallel human genome analysis:microarray-based expression monitoring of 1000 genes[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996,93(20):10614-10619.

[5]卢 兴.急性心肌缺血综合征的病理生理及其临床意义[J].生理科学进展，1991，22（1）：81－92．

[6]林亚平，易受乡，严 洁，等．电针内关对心肌缺血再灌注损伤家兔腺苷酸的影响[J].中医药学刊，2003，21（10）：1637－1638．

[7]田岳凤，李雷勇，王 军，等．针刺手厥阴心包经穴对大鼠缺血再灌注损伤心肌组织ATP、ADP和AMP的影响[J].中国中医药科技，2007，14（1）：1－2．

Effect of acupuncture at Neiguan acupoint on the gene expression profile of rats with acute myocardial ischemia

LIANG Xian-ru1,XI Qiang2,LI Xiao-mei2,CUI Rui2,JIN Guang2,GUO Yi2,GUO Yong-ming2
（1．Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Troop,Tianjin 300262,China; 2.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To study the effect of acupuncture on the gene expression profile in acute myocardial ischemia.[Methods]Aacute myocardial ischemic was induced by ligating the left anterior descending branch of coronary artery,and the total RNA of the ischemic myocardium was extracted after grouping and intervention.Afterwards,we hybridized the extraction with the whole gene expression profile chip in rat and detected them.In the differential expressed gene during therapeutic process after screening,we searched and analyzed the compound functional classification of the significant aggregative differential expression by the means of gene functional classification system and discussed the effect of acupuncture on the gene expression profile in acute myocardial ischemia from the level of gene function.[Results]The expression of 398 genes was up-regulated after 24 hours of myocardial ischemia.However,the expression of 298 gene (74.87%of the total up-regulated genes)showed the tendency of down-regulation after acupuncture at Neiguan acupoint three times intermittently;in the 338 down-regulated genes after 24 hours of myocardial ischemia,the expression of 188 genes(55.62%of the total downregulated genes)showed the tendency of up-regulation after acupuncture at Neiguan acupoint three times intermittently,indicating a benign regulative action of the expression of ischemia myocardium gene after acupuncture at Neiguan acupoint.In the screened differential expression genes,the functional module of Ppm1b,Suclg1,Got2,Mdhl,PDP1,Fh,Cpb2,Ywhaz,S100A9,Atp1b1,TnI,Myl3,Casq2, Mb,mainly involved the oxidative phosphorylation,the electron transfer of mitochodria,the electron transfer coupling of ATP synthesis, the energy metabolism,the process of phoshates metabolism,the univalent inorganic cation transfer,the process of coenzyme metabolism and so on.[Conclusion]Acupuncture at Neiguan acupoint may protect the myocardium by influencing the genes mentioned above.

acupuncture;acute myocardium ischemia;expression of gene function

R245.3

A

1672-1519（2012）04-0349-07

2012-04-26）

天津市高等学校科技发展基金项目（020327）。

梁宪如（1974-），女，硕士，主治医师，主要研究方向为传统针刺手法作用机制及临床应用研究。

郭永明。