一起O139群霍乱弧菌感染的病原学检测分析

龚令旗

湖南省益阳市资阳区疾病预防控制中心，湖南益阳413001

霍乱是由一群和Ο139群霍乱弧菌引起以腹泻为主要症状的甲类传染病，在我国尤其是近几年来因食用海水产品引起霍乱弧菌感染的事件逐年升高。为了查明霍乱疫情发生的原因，以及传统的分离培养方法和胶体金快速免疫层析法的比较，2010年10月该市某村也发生一起因食用甲鱼引起感染的霍乱疫情，经流行病学调查及实验室病原检测，证实是由霍乱弧菌Ο139群感染引起的，现将其病原学检测情况报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

患者腹泻物、家属和部分聚餐人员的肛拭子共计33份，病家水缸水、井水以及患者购买甲鱼的徐记水产品批发部处的甲鱼、牛娃等海水产品及甲鱼暂时养殖水共计25份。

1.2 实验设备，检测试剂及培养基

碱性蛋白胨，庆大霉素琼指，微量生化鉴定管均购自杭州天和微生物试剂有限公司，霍乱弧菌Ο1群和Ο139群血清购自中国药品生物制品检定所，霍乱弧菌Ο1群和Ο139群胶体金快速检测条购自北京庄笛浩禾生物有限公司。所有试剂及培养基均在有效期内使用，实验室内质控和室间质评均符合要求。

1.3 方法

1.3.1 胶体金快速免疫层析试验法 将霍乱弧菌Ο139群和Ο1群胶体金快速检测条放置于洁净干燥工作台上，用吸管取患者腹泻物，密切接触者扛拭子增菌液以及相关甲鱼的一二次增菌液各2～3滴，滴入检测条加样端15 min内观察结果。

1.3.2 常规菌株分离 按《霍乱防治手册》（5版）进行[1]患者腹泻物、可疑者肛拭子直接接种10 mL碱性蛋白胨水中增菌6～8 h后，划线接种庆大霉素琼脂平板，井水和甲鱼养殖水标本450 mL，调pH9.0加50 mL 10倍浓缩碱性胨水，以无菌方式采集甲鱼内脏25 g接种225 mL碱性胨水，增菌6～8 h，划线接种庆大霉素琼脂平板分纯培养，同时取0.1～0.2 mL表层培养物转种10 mL碱性胨水作二次增菌后划线接种庆大霉素琼脂（36±1）℃培养18～24 h，挑取可凝菌落染色镜检。同时挑取庆大霉素琼脂上中等大小露水状半透明灰色菌落与Ο1群和Ο139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验，用生理盐水作对照。同时分纯菌落做生化反应鉴定，并将所分离的阳性菌株送省级疾控中心进行相关毒力基因的鉴定以确定其型别。

2 结果与分析

2.1 胶体金试纸条检测结果

所有内外环境标本Ο1群霍乱弧菌胶体金快速试纸条结果全部阴性，除患者腹泻物，1名密切接触者徐记水产品批发处的甲鱼内脏及该甲鱼的养殖水的第二次增菌液等4份标本为Ο139群霍乱弧菌胶体金试纸条结果阳性外，其余均为阴性，见表1。

表14 株Ο139群霍乱弧菌检测结果

2.2 常规法分离菌株的检测结果

33份内环境标本中从患者腹泻物和密切接触者中分离出2株Ο139群霍乱弧菌，25份外环境标本中甲鱼内脏及该甲鱼养殖水分离出2株Ο139群霍乱弧菌，4株Ο139群霍乱弧菌阳性菌株均分解葡萄糖，麦芽糖，甘露醇，蔗糖，不分解阿拉伯糖，乳糖，赖氨酸脱羧酶阳性，鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸脱羧酶阴性，氧化酶阳性，粘丝试验阳性，有动力，0%氯化钠生长、6%氯化钠生长，10%氯化钠不生长，不产生硫化氢。送省级疾控中心的4株阳性菌株通过PCR扩增进行霍乱弧菌毒力基因的检测，结果霍乱弧菌毒力基因ctxA、zot.ace均为阳性，说明其属同一型别。4株Ο139群霍乱弧菌检测结果，见表1。

3 讨论

霍乱弧菌可通过水、食物、生活接触和苍蝇等途径传播。本次疫情经流行病学调查和实验室病原学检测分析，确定为一起食用甲鱼引起的霍乱弧菌Ο139群感染。依据：本次霍乱弧菌阳性甲鱼标本来自患者购买的同一批发处，通过对患者，甲鱼及甲鱼养殖水分离出来的阳性菌株进行PCR毒力基因检测，结果四株阳性菌株均为具有同一毒力基因的产毒株[2]。

当前随着人们生活水平的提高，因聚餐食用海水产品引起霍乱疫情的事件不断增加[4]，因此建立快速，准确检测病原菌感染的检测方法是有效控制疫情蔓延的重要手段。目前，霍乱弧菌病原菌感染诊断的金标准仍然是菌株的成功分离，通过增菌、分离培养及血清学生化鉴定等一系列步聚来完成，但灵敏度低，操作较繁琐，耗费时间长，不适合基层医疗单位采用；而胶体金快速检测法灵敏度高，特异性强，操作简单，可作为最基层医疗单位的筛查，可以快速提供筛查报告，为控制疫情蔓延争取时间，但其容易失效，稳定性稍差，容易出现假阳性[3]，且拿不到菌株。因此在发生疫情的病原学诊断时，为预防漏检和缩短时间，笔者建议两种方法同时采用。另外在本次试验中，密切接触者的肛拭子第一次增菌培养物胶体金法快速检测霍乱弧菌Ο139群为弱阳性，可能与其含有的菌量过少有关，为慎重起见，研究对其进行两次增菌后进行分离培养。而在甲鱼养殖水的第一次增菌后用常规细菌分离未检出阳性菌株，第二次增菌后才检出阳性菌株，这可能与其甲鱼的换水消毒导致菌量过少有关。为提高检出率，建议今后的监测中应进行二次增菌，且每个平板至少挑取5个菌落进行玻片凝集。

为预防进食甲鱼引起的霍乱发病，各级卫生部门应加强海水产品卫生管理措施[4]，同时也应加大卫生宣传力度，特别是在经济条件和卫生条件较差的农村，加工甲鱼时一定要生熟分开，甲鱼要煮熟煮透后食用。

[1] 卫生部卫生防疫司.霍乱防治手册菌[M].5版.北京:卫生部疾病控制司,1999.

[2] 郑向梅,吕均.两株霍乱弧菌同源性分析[J].现代预防医学,2010,37(23):4508.

[3] 王琼妹,周登仁,徐海英,等.胶体金法应用于外环境标本中霍乱弧菌的检测[J].中国热带医学,2010(11):1374-1375.

[4] 曹卫中,陆春香,蔡藕菊,等.崇明县海水产品霍乱弧菌污染状况调查[J].中国卫生检验杂志,2007,17(9):1725-1726.