不同检测方法对妊娠晚期B族链球菌的筛查比较

樊春卉 金 娴▲ 朱平安 谭 萍 张艮芳 黄晓彤 陈 芳

1.深圳市盐田区人民医院检验科，广东深圳 518081；2.深圳市盐田区人民医院妇产科，广东深圳 518081

B族链球菌（GBS）是孕妇围生期感染中比较常见的病原菌，又叫无乳链球菌。目前全球范围内GBS的检出率有所差异，受地区、种族差异及检测方法不一影响，检出率在5%～30%[1-2]。直接接种细菌培养法对实验条件没有太高的要求，不少医院均可以做到，但是检出率较低，甚至会出现漏诊的情况，对GBS治疗造成一定的影响。有报道称免疫层析法和实时荧光定量PCR法（以下简称“PCR法”）能快速检测GBS，且有很高的检测率[3-4]。本研究采用不同检测方法对选择性肉汤培养基增菌进行前后检测，并统计分析各方法的检测结果，为临床不同GBS检测需求提供合理的检测方案，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年4月～2019年7月于深圳市盐田区人民医院接受产检的702例妊娠晚期孕妇作为研究对象，年龄22～39岁，平均（28.3±3.9）岁；孕龄35.2～37.1周，平均（35.9±0.6）周。纳入标准：35周≤孕龄＜38周；孕妇知情同意且签署同意书。排除标准：1周内使用过抗菌药或阴道周围外用清洗剂的孕妇。本研究经深圳市盐田区人民医院医学伦理委员会批准后开展。

1.2 试剂、仪器和方法

1.2.1 试剂和仪器 选择性肉汤培养基（青岛海博生物科技有限公司）；血平板（郑州安图生物工程有限公司）；细菌鉴定仪器（法国生物梅里埃公司，型号：VITEK2 COMPACT）；免疫层析试剂盒（北京金沃夫生物工程技术有限公司，批号20170801）；全自动荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司，型号：ViiA 7Dx）；GBS核酸检测试剂盒、阴性和阳性对照试剂盒（中山大学达安基因有限公司，批号2018001）。

1.2.2 方法 ①采集标本：标本为研究对象阴道-直肠分泌物。②增菌培养：将样品置于选择性肉汤培养基中增菌，在浓度为5%～10%二氧化碳培养箱中培养18 h，温度设置为35℃，本次操作方式实施无菌操作。③分离培养及鉴定：将增菌前的样品及增菌液接种于血平板，依旧在浓度为5%～10%二氧化碳培养箱中培养18～24 h，温度同样设定为35℃。血平板上可疑的GBS菌落呈灰白色，表面光滑凸出，透光。疑似菌落生化鉴定：革兰染色阳性，触酶试验阴性，CAMP试验阳性，再上机鉴定为无乳链球菌。分别选择无乳链球菌和化脓性链球菌的质控菌株作为阳性对照与阴性对照。④免疫层析法检测：增菌前样本和1 mL增菌液进行检测，操作方式按照试剂盒要求实行。⑤PCR法检测：增菌前样本加入1 mL生理盐水振荡及增菌液1 mL离心后弃上清，再分别加入DNA提取液，100℃裂解10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液5 μL作为模板实施PCR扩增，其结果判定依据试剂盒说明书。

1.3 评价标准

金标准以增菌后的细菌培养法为准，对不同检测方式的灵敏度、特异度、准确性和一致性实施分析比较。灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%，准确性=（真阳性+真阴性）/总例数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验；各组检查实施相同性的Kappa检验，若Kappa＞0.6则存在较好的一致性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直接接种细菌培养法与增菌细菌培养法检测结果的比较

直接接种细菌培养法与增菌细菌培养法的检测结果见表1。增菌后细菌培养法阳性检出率为9.4%（66/702），直接接种细菌培养法阳性检出率为2.8%（20/702），两种检测方法的阳性检出率比较，差异有统计学意义（χ2=26.210，P=0.000）。直接接种细菌培养法的灵敏度为27.3%（18/66），特异度为99.7%（634/636），准确性为92.9%（652/702），一致性检测Kappa=0.392。

表1 直接接种细菌培养法与增菌细菌培养法的检测结果（例）

2.2 免疫层析法和增菌细菌培养法检测结果的比较

免疫层析法与增菌细菌培养法的检测结果见表2。增菌前和增菌后的免疫层析法阳性率分别为4.6%（32/702）、13.8%（97/702），免疫层析法增菌前后的阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=36.066，P=0.000）。增菌前免疫层析法检测的灵敏度为36.4%（24/66），特异度为98.7%（628/636），准确性为92.9%（652/702），一致性检测Kappa=0.456。增菌后免疫层析法检测的灵敏度为80.3%（53/66），特异度为93.1%（592/636），准确性为91.9%（645/702），一致性检测Kappa=0.606。免疫层析法增菌前后的灵敏度比较，差异有统计学意义（χ2=26.213，P=0.000）；免疫层析法增菌前后的特异度、准确性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 免疫层析法与增菌细菌培养法的检测结果（例）

2.3 PCR法与增菌细菌培养法检测结果的比较

PCR法与增菌细菌培养法的检测结果见表3。增菌前和增菌后PCR法阳性率分别为8.5%（60/702）、12.5%（88/702），PCR法增菌前后的阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=5.922，P=0.015）。增菌前PCR法检测的灵敏度为65.2%（43/66），特异度为97.3%（619/636），准确性为94.3%（662/702），一致性检测Kappa=0.651。增菌后的灵敏度为87.9%（58/66），特异度为95.3%（606/636），准确性为94.6%（664/702），一致性检测Kappa=0.724。PCR法增菌前后的灵敏度比较，差异有统计学意义（χ2=9.486，P=0.002）；PCR法增菌前后的特异度、准确性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 PCR法与增菌细菌培养法的检测结果（例）

3 讨论

我国于2010年出台对GBS筛查指南，直接接种细菌培养法在各大医院得到广泛应用。但有文献指出[5-6]，直接接种细菌培养法的阳性检出率很低，导致有漏诊情况的发生。近年来，国内医院开始采用选择性肉汤培养基进行细菌培养，许多研究表明，增菌后的细菌培养有很高的阳性检出率[7-9]。此外有研究表明[10-11]，免疫层析法或PCR法在临床中利于阳性检出率的提高，对于临床GBS筛查更适用。

本研究结合文献对不同筛选方式进行探讨，结果显示，增菌后细菌培养法阳性检出率高于直接接种细菌培养法，差异有统计学意义（P＜0.05），与相关文献报道[12]相似，提示采用选择性肉汤培养基可提高阳性检出率。其主要原因是选择性肉汤培养基中含有萘啶酸、黏菌素等抗菌药物，能很好地抑制受试者阴道-直肠标本中非目标细菌的生长。此外，用免疫层析法和PCR法对增菌前后的样品进行检测，结果显示，免疫层析法增菌前阳性率为4.6%，与顾向明等[13]研究结果（5.74%）相当；但增菌后免疫层析法阳性率为13.8%，显著高于增菌前，差异有统计学意义（P＜0.05）。增菌前PCR法阳性率为8.5%，增菌后PCR法阳性率为12.5%，增菌后显著高于增菌前，差异有统计学意义（P＜0.05）。以增菌后细菌培养法检测为金标准，结果显示，免疫层析法和PCR法在增菌后的检测灵敏度高于增菌前检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；免疫层析法与PCR法增菌后的特异度与准确性与其增菌前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在一致性评价中，免疫层析法增菌前的Kappa值低于0.6，增菌后Kappa值高于0.6，提示增菌后免疫层析法的临床可靠性更高。而增菌前后PCR法的Kappa值均高于0.6，且均高于免疫层析法，提示PCR法的可靠性略优于免疫层析法。考虑该两种方法对于细菌培养法中GBS生长发育的状况可以不予考虑，而且可以检测出非β型溶血性GBS及CAMP阴性的B族链球菌，因此其阳性检出率会更高。免疫层析法检测比较方便易上手，专业技术要求低，检测时间较短，灵敏度相对不高，但经过选择性肉汤培养基增菌后可弥补其灵敏度较低的不足，适合基层医院临床初步检测[14]。而PCR法相对有些复杂，但其灵敏度更高，一致性更好，不过要采用全自动荧光定量PCR仪，完成批量检测的检验时间需要3 h，对于基层地区医院来说，检测要求较高，医疗条件较好的医院推荐使用PCR法[15-16]。

综上所述，选择性肉汤培养基增菌后阳性检出率更高，细菌培养法检测准确但是耗时较长且对工作人员专业水平要求较高。增菌后的免疫层析法检测方便快捷弥补了灵敏度相对较低容易出现假阴性的缺点，可作为基层医院妊娠晚期GBS初步筛查方式。PCR法则具备灵敏度较高、一致性好且检测耗时短、可批量操作的优点，优先推荐具备PCR检测手段的医院使用PCR法检测。