类胚体形成对P19细胞向心肌细胞分化的影响

尹 青，陈 炜，李 莉，谢丹丹，龚 淼

(河北医科大学组织学与胚胎学教研室，石家庄050017)

P19细胞是一种具有胚胎干细胞特性的小鼠畸胎瘤细胞系，其在体外单层培养条件下多次传代可保持干细胞特性，条件培养可分化为包括心肌细胞［1～3］在内的多种细胞。P19细胞向心肌细胞分化过程中细胞发育相关基因的表达及电生理学特征基本模拟了正常小鼠心肌发育过程［4］，且易于培养、转染，是研究心肌细胞发育及相关基因转录调控的理想体外细胞系统。2010年5月～2011年2月，我们应用心肌细胞条件培养液培养P19细胞及P19细胞类胚体(EBs)并观察了P19细胞的生长、分化状态，旨在探讨心肌环境因素及EBs形成对细胞分化的作用及心肌细胞的分化机制，为胚胎干细胞体外诱导分化机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 新生1～3 d的SD大鼠，雌雄不限(河北省实验动物中心)。小鼠 P19细胞系(ATCC，CRL-1825，中国协和医科大学细胞中心)。α-MEM培养基(美国Gibco公司)。心肌肌钙蛋白T(cTnT)单克隆抗体(英国Abcam公司)，心肌细胞缝隙连接蛋白43(Connexin43，Cx43)单克隆抗体(美国 Invitrogen公司)。

1.2 P19细胞聚集培养 取复苏传代4代以上P19细胞，以0.25×106/mL密度接种于铺有0.5%软琼脂［5］的96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每2 d半量换液，诱导4 d形成EBs或细胞聚集体。

1.3 心肌细胞分离培养及心肌细胞条件培养液制备 将新生SD大鼠心室组织剪成1 mm3大小的碎块，加入3倍稀释的0.25%胰酶与0.02%EDTA的混合液，37℃重复消化心肌组织，200目尼龙网过滤，收集滤液，1 000 r/min离心。取细胞沉淀制成单细胞悬液，差速贴壁法纯化心肌细胞。将心肌细胞以4×105/mL密度接种于培养瓶中，每日收集培养液，离心，取上清液与α-MEM培养液1∶1混合，制备心肌细胞条件培养液。

1.4 P19细胞分化诱导 将P19细胞随机分为四组，对照组将P19细胞以0.25×106/mL密度接种于铺有盖玻片的6孔板中，用α-MEM培养基培养;条件液培养组将P19细胞以0.25×106/mL密度接种于6孔板中，用心肌细胞条件培养液培养;EBs组将P19细胞EBs接种于6孔板中，用 α-MEM培养基培养。EBs+条件培养液组将P19细胞EBs接种于6孔板中，用心肌细胞条件培养液培养。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。

1.5 cTnT及Cx43表达检测 ①免疫组化SP法:取各组培养7、10 d时的细胞，4%多聚甲醛固定后，按SP法进行免疫细胞化学染色［5］，观察 cTnT表达。②Western blot法:收集各组培养7、10 d时细胞，提取总蛋白。定量后的蛋白各取80μg，PVDF膜转移后用脱脂奶粉封闭。一抗分别为cTnT(1∶1 000)，Cx43(1∶400)，4 ℃过夜。ECL 试剂盒检测免疫活性蛋白。以β-actin作为内参，用Image J软件进行定量分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。所有计量数据用¯x±s表示，各组比较采用单因素方差分析或配对t检验，当方差分析有显著性差异时进一步用q检验做两两比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 心肌细胞生长状态 倒置相差显微镜下可见心肌细胞贴壁后细胞逐渐伸出突起，细胞核圆形，体积较大，培养2～3d后细胞伸出突起交织成网，细胞同步搏动，频率多为60～120次/min。对照组与条件液培养组P19细胞贴壁生长，增殖速度较快，细胞大量堆积，出现接触性死亡。EBs组与EBs+条件培养液组EBs黏附生长，EBs中央聚集细胞坏死，形成坏死区，细胞由EBs边缘爬出，在EBs周围形成生长晕，部分细胞体积增大，呈梭形或杆状且彼此相连。各组均未观察到跳动细胞。

2.2 cTnT及Cx43表达 免疫组化SP法检测示对照组与条件液培养组未见cTnT阳性细胞。EBs组与EBs+条件培养液组在EBs周围可见cTnT阳性细胞，EBs+条件培养液组阳性细胞数多于EBs组，散在或聚集分布于EBs周围的生长晕中，随培养时间延长，阳性细胞数有增多趋势。Westernblot法检测结果示对照组与条件液培养组未发现cTnT和Cx43表达。培养7、10d时EBs+条件培养液组cT-nT和Cx43表达均明显高于EBs组(P均＜0.05，图1，图2)。EBs+条件培养液组cTnT和Cx43表达第10天时显著高于第7天(P均＜0.01，图1，图2)。

3 讨论

心肌细胞不可逆性坏死、功能性细胞数量下降等所致的心力衰竭是心血管疾病患者的主要死亡原因之一。近年来对干细胞的深入研究发现，干细胞移植治疗可取代受损心肌细胞并重建血运。但干细胞向心肌细胞分化的机制尚不清楚，如何有效诱导干细胞向心肌细胞分化是亟待解决的问题。

图1 两组cTnT表达

图2 两组Cx43表达

P19细胞是从小鼠畸胎瘤中分离得到的具有胚胎干细胞特性的胚胎畸瘤细胞，与胚胎干细胞在分化潜能、超微结构及细胞表面抗原和生化特性等方面具有相似性，由于其在心肌细胞发育过程中与小鼠胚胎干细胞有相似的特性，故常被作为研究心肌细胞早期分化的模型系统［4］。以往的研究中多应用化学试剂(二甲基亚砜、视磺酸、5-氮胞苷等)诱导P19细胞的分化，但化学诱导剂具有一定毒性，限制了其应用。目前认为，心脏微环境对于干细胞的分化具有重要的诱导作用，但心脏环境较为复杂，具体何种因素影响干细胞向心肌细胞分化目前尚不清楚。

cTnT为细胞骨架蛋白，只在心肌细胞特异性表达;Cx43是心肌细胞间的主要连接蛋白，心肌细胞间电信号的传导有赖于Cx43结构和功能的完整性，二者均是鉴定心肌细胞分化的常用指标。本研究结果显示，P19细胞在心肌细胞条件培养液中单层培养条件下无cTnT、Cx43表达，表明单纯的心肌细胞外环境不能刺激诱导P19细胞分化为心肌细胞。Rangappa 等［6～8］研究发现，条件培养或间接接触共培养条件下培养骨髓间充质干细胞，未发现心肌细胞特异性基因表达。由此可见，心肌细胞、成纤维细胞等心脏组织细胞的分泌物不足以诱导干细胞向心肌细胞分化，或许与所选用细胞与细胞所处心肌细胞条件培养液的浓度、生长发育时间有关。

EBs作为胚胎干细胞诱导分化模型，在诱导细胞分化的研究中广泛应用［9］。在胚胎发育和体外实验中发现［10～12］，内脏内胚层细胞条件培养及直接接触培养均可诱导ESCs向心肌细胞分化。中胚层向终末心肌细胞的分化过程中受到中胚层，特别是内胚层的信号诱导及基因调控。在细胞聚集体形成过程中心肌细胞早期转录因子GATA-4表达量增加，可促进干细胞向心肌细胞分化。我们的研究显示，EBs在自然培养条件下，部分细胞表达心肌细胞特异cTnT，而单层培养P19细胞无心肌细胞分化，表明EBs或细胞聚集体的形成或许模拟了早期胚层形成过程，对于促进心肌细胞分化具有重要作用;而EBs形成结合心肌细胞条件培养液培养后心肌细胞cTnT及Cx43表达明显高于EBs自然培养，表明心脏组织液可促进P19心肌细胞特异蛋白的表达，促进细胞分化。本实验中均未观察到跳动细胞，可能与细胞诱导时间及分化细胞的数量有关。

总之，EBs形成结合心肌细胞条件培养液培养可有效促进P19细胞向心肌细胞分化，具体分化机制有待进一步研究。而干细胞向心肌细胞分化是一极其复杂的过程，如何诱导分离大量的心肌细胞用于细胞移植治疗仍需深入研究。

［1］Jasmin，Spray DC，Campos de Carvalho AC，et al.Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells［J］.Stem Cells Dev，2010，19(3):403-412.

［2］Zhu C，Hu DL，Liu YQ，et al.Fabp3 inhibits proliferation and promotes apoptosis of embryonic myocardial cells［J］.Cell Biochem Biophys，2011，60(3):259-266.

［3］Jihyun Y，Seok JK，Beom SK，et al.Enhanced cardiomyogenic differentiation of P19 embryonal carcinoma stem cells［J］.Korean Circ J，2009，39(5):198-204.

［4］van der Heyden MA，van Kempen MJ，Tsuji Y，et al.P19 embryonal carcinoma cells:a suitable model system for cardiac electrophysiological differentiation at the molecular and functional level［J］.Cadriovasc Res，2003，58(2):410-422.

［5］尹青，张雷，赵昱，等.应用二甲基亚砜体外诱导P19细胞分化为心肌细胞［J］.解剖学报，2006，37(2):219-222.

［6］Rangappa S，Entwistle JW，Wechsler AS，et al.Cardiomyocyte-Mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype［J］.Thorac Cardiovasc Surg，2003，126(1):124-132.

［7］Schuleri KH，Boyle AJ，Hare JM.Mesenchymal stem cells for cardiac regenerative therapy［J］.Handb Exp Pharmacol，2007，180(2):195-218.

［8］Mygind T，Stiehler M，Baatrup A，et al.Mesenchymal stem cell in growth and differentiation on coralline hydrayapatitle scaffolds［J］.Biomaterials，2007，28(6):1036-1047.

［9］范新兰，孟春玲，麦友刚，等.人胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，46(11):9413-9415.

［10］曾彬，林国生，蔡军.转化生长因子-β1联合内脏内胚层样END-2细胞共培养对小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的实验研究［J］.解剖学报，2006，37(6):715-719.

［11］岳晓珊，长冈正人，赤池敏宏，等.P19细胞心肌体外分化诱导条件的优化［J］.基础医学与临床，2008，28(2):177-180.

［12］Areeci RJ，King AA，Sinon MC，et al.Mouse GATA-4:a retinoic acid-inducible GATA-binding transcription factor expressed in endodemally derived tissue and heart［J］.Mol Cell Biol，1993，13(4):2235-2246.