TLR4与TLR9在原发性肝癌组织中的表达及意义

刘晓聪，朱慧芬，杨道锋，曹旭东，邓科兰，黄春梅，胡晓萌，陈琰琰，姜素华，沈关心

(1石河子大学医学院生化教研室，石河子832002;2华中科技大学同济医院;3石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室;4华中科技大学同济医学院)

据报道，目前，我国主要的慢性肝病是乙型肝炎病毒感染所致的慢性病毒性肝炎后肝硬化［1］，可最终发展成肝癌。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是Ⅰ型跨膜蛋白，能识别侵入体内的微生物进而激活免疫细胞应答，被认为在先天性免疫系统中起关键作用。据报道，TLRs家族中TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及 TLR9与病毒感染性疾病密切相关［2］。本研究通过免疫组织化学及流式细胞术分别检测原发性肝癌癌组织、相应癌旁组织及肝血管瘤组织中TLR4、TLR9的表达，旨在探讨二者在肝癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 110例临床病理诊断为原发性肝癌患者的癌组织及相应癌旁组织标本，患者男93例，女17例，年龄22～74岁，平均52岁;血清学检测证实患者均有乙肝感染史。同期肝血管瘤患者瘤组织标本10份，患者男5例，女5例，年龄37～55岁，平均44岁;乙肝相关指标均为阴性。主要试剂及仪器有PE-anti-human TLR4、PE-anti-human TLR9(eBio-sience公司)，小牛血清以及胎牛血清(杭州四季青公司)，消化酶(Clostridium histolyticum，Gibco，武汉天傲生物分装)，1640培养液(Gibco公司)，FACS Calibur流式细胞仪(BD LSRⅡ，美国)，免疫组化TLR4、TLR9一抗(博士德生物工程，武汉/Abcam公司，美国)，免疫组化染色试剂盒Envision HRP兔鼠通用 二抗(上海基因科技)，NU-6613V31型－80℃低温冰箱，Sigma 4 K15低温离心机(Sigma，Germany)。

1.2 TLR4、TLR9水平检测 ①免疫组化法:采用Elivision二步法进行免疫组化染色，具体步骤参照试剂盒推荐步骤进行，抗TLR4单克降抗体稀释度为1∶100，抗 TLR9 单克降抗体稀释度为 1∶50，DAB显色，用柠檬酸微波法进行抗原修复，以PBS代替抗体作为阴性对照组。采用综合评分法，高倍镜下随机计数5个视野，计算阳性细胞所占百分比。阳性细胞占所有细胞的比例≤10%为0分，11% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，≥76%为4分;凡细胞质或细胞核呈浅棕色为1分、棕色为2分、深棕色为3分、不着色为0分。上述两积分相乘:0分为阴性(－)、1～4分为弱阳性(+)、5～8分为中等阳性(++)、9～12分为强阳性(+++)，并以Image-Pro Plus 6.0软件进行组化图像分析。②直接免疫荧光流式细胞术(FCM):将获取的新鲜肝癌、癌旁及肝血管瘤组织标本剪成1 mm3组织块，用无钙、无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化，以用DMEM液终止胶原酶的作用。Facoll管中各自加入PE-anti-human TLR4抗体5μL、PE-anti-human TLR9抗体20μL和每管加入已计数的相应细胞量，混匀，每管设阴性对照，按常规方法室温、避光孵育30 min，4 mL PBS常温1 200 g离心5 min/3次洗涤后，再加入0.5～1 mL PBS重悬，FCM上机检测，并用Cellquest软件分析TLR4、TLR9的平均荧光强度及阳性表达率。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，对计数数据进行t检验和秩和检验，Spearman等级相关检测相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

免疫组化法示癌旁组织主要呈现出慢性炎症及肝硬化的病理表现，TLR4及TLR9主要为浆/膜表达，而细胞核中无表达(图1)。肝癌、癌旁及肝血管瘤组织中 TLR4表达阳性率分别为0.058 434、0.653 51、1，两两比较，P 均 ＜0.05;TLR9 表达阳性率分别为0.819 10、0.370 18、0.079 54，两两比较，P均＜0.05。FCM检测与免疫组化染色法结果一致，见图2。肝癌、癌旁及肝血管瘤组织中TLR4表达荧光强度分别为2 168、2 453、2 616，两两比较，P 均 ＜0.05;TLR9 表达分别为 2 280、1 907、1 428，两两比较，P 均 ＜0.05。

图1 肝癌组织、癌旁组织、肝血管瘤组织中TLR4、TLR9表达(IHC ×200)

3 讨论

研究发现，慢性乙型肝炎病毒感染所致的慢性肝炎和肝硬化是原发性肝癌最主要的因素，TLRs是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，亦是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLRs通过识别病原相关分子模式(Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)及某些内源性配体引发信号转导并导致炎症介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统。以往研究认为TLRs主要表达于免疫细胞中，但越来越多的证据表明某些肿瘤细胞亦表达TLRs，TLRs参与调节肿瘤细胞的增殖、存活以及药物敏感性［3，4］。

TLR4为TLR的一种，主要识别革兰阴性菌脂多糖。新近研究发现，TLR4基因突变或基因多态性与肝癌的发生或恶性程度密切相关［5］。肿瘤组织在侵袭过程中可产生活性氧或应激保护性因子，细胞坏死崩解释放肿瘤抗原，所有的这些因子可成为TLR4的内源性配体，从而激活TLR信号途径，促进抗原呈递细胞的成熟，进而活化T细胞引起特异性抗肿瘤免疫。TLR4信号途径的激活有助于抗肿瘤免疫的启动。研究发现，TLR4在慢性肝炎患者的肝组织中表达上调，而TLR4在肝癌组织中较癌旁组织表达降低［6，7］。本研究发现 TLR4在肝癌组织中表达低于癌旁及肝血管瘤组织，与文献报道结果一致。原因可能为HBV基因编码的病毒蛋白发挥拮抗TLR介导的固有免疫应答作用，乙肝病毒通过拮抗TLR4表达促进肝癌的发生。

研究显示，TLR9的外源性配体为细菌和病毒DNA中未甲基化的CpG序列，内源性配体为含低甲基化CpG序列的自身DNA，亦是免疫细胞识别病毒和细菌中非甲基化DNA的必需成分。TLR9位于内质网，UNC93B1同样位于内质网内，激活以后，TLR9依赖UNC93B1的方式转移到内体/溶酶体，从而招募适配体蛋白MyD88，通过依赖MyD88的途径激活IRF、AP-l、NF-κB 等转录因子，以产生大量的Ⅰ型干扰素和多种炎症细胞因子，从而诱导干扰素的产生和一系列免疫应答机制，发挥免疫应答效应［8～10］。研究发现，TLR9除表达于正常上皮外，在肿瘤细胞中亦有表达，如乳腺癌、中枢系统肿瘤、肺癌、胃癌及前列腺癌等［11～15］。Tanaka 等［16］证实 TLR9 在 85.7%的肝癌组织中表达，利用CpG-ODN激活TLR9通路后发现细胞增殖加快，耐药性增加，进一步发现TLR9激活后凋亡抑制因子(Survivin、Bcl-xL、XIAP等)上调，而TLR9抑制剂处理后诸多相关癌基因下调。本研究结果显示，TLR9在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织和肝血管瘤肝组织，提示乙肝病毒可能充当外源性CpG相似的作用，激活TLR9通路并产生一系列生物学效应，从而促进肝癌的发生、发展。

综上所述，TLR4、TLR9与肝癌的发生、发展有关，机制可能为乙肝病毒通过拮抗TLR4表达、激活TLR9通路促进肝癌的进展。

［1］Salhab M，Canelo R.An overview of evidence-based management of hepatocellular carcinoma:a meta-analysis［J］.J Cancer Res Ther，2011，7(4):463-475.

［2］Thompson MR，Kaminski JJ，Kurt-Jones EA，et al.Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection［J］.Viruses，2011，3(6):920-940.

［3］Chen R，Alvero AB，Silasi DA，et al.Cancers take their Toll-the function and regulation of Toll-like receptors in cancer cells［J］.Oncogene，2008，27(2):225-233.

［4］Huang B，Zhao J，Unkeless JC，et al.TLR signaling by tumor and immune cells:a double-edged sword［J］.Oncogene，2008，27(2):218-224.

［5］Minmin S，Xiaoqian X，Hao C，et al.Single nucleotide polymorphisms of Toll-like receptor 4 decrease the risk of development of hepatocellular carcinoma［J］.PLoSOne，2011，6(4):e19466.

［6］Wei XQ，Guo YW，Liu JJ，et al.The significance of Toll-like receptor 4(TLR4)expression in patients with chronic hepatitis B［J］.Clin Invest Med，2008，31(3):E123-130.

［7］Guo YW，Li YW，Wei XQ，et al.Expression of TLR2 and TLR4 in hepatocellular carcinoma［J］.Chin J Pathophysiol，2008，24(10):1912-1915.

［8］Merrell MA，Ilvesaro JM，Lehtonen N，et al.Toll-like receptor 9 agonists promote cellular invasion by increasing matrix metalloproteinase activity［J］.Mol Cancer Res，2006，4(7):437-447.

［9］El Andaloussi A，Sonabend AM，Han Y，et al.Stimulation of TLR9 with CpG ODN enhances apoptosis of glioma and prolongs the survival of mice with experimental brain tumors［J］.Glia，2006，54(6):526-535.

［10］ Droemann D，Albrecht D，Gerdes J，et al.Human lung cancer cells express functionally active Toll-like receptor 9［J］.Respir Res，2005，6(1):1-10.

［11］Schmausser B，Andrulis M，Endrich S，et al.Toll-like receptors TLR4，TLR5 and TLR9 on gastric carcinoma cells:an implication for interaction with Helicobacter pylori［J］.Int J Med Microbiol，2005，295(3):179-185.

［12］Ilvesaro JM，Merrell MA，Swain TM，et al.Toll-like receptor-9 agonists stimulate prostate cancer invasion in vitro［J］.Prostate，2007，67(7):774-781.

［13］Leifer CA，Kennedy MN，Mazzoni A，et al.TLR9 is localized in the endoplasmic reticulum prior to stimulation［J］.J Immunol，2004，173(2):1179-1183.

［14］Brinkmann MM，Spooner E，Hoebe K，et al.The interaction between the ER membrane protein UNC93B and TLR3，7 and 9 is crucial for TLR signaling［J］.JCell Biol，2007，177(2):265-275.

［15］Kim YM，Brinkmann MM，Paquet ME，et al.UNC93B1 delivers nucleotide-sensing toll-like receptors to endolysosomes［J］.Nature，2008，452(7184):234-238.

［16］Tanaka J，Sugimoto K，Shiraki K，et al.Functional cell surface expression of toll-like receptor 9 promotes cell proliferation and survival in human hepatocellular carcinomas［J］.Int JOncol，2010，37(4):805-814.