中国广西人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多态性研究

蓝 艳，卢 冬，王春芳，潘国刚，韦叶生

(右江民族医学院附属医院，广西百色533000)

Nogo基因是新近发现的轴索生长抑制因子(Neurite growth inhibitor)，具有抑制中枢神经再生的作用［1］。RTN4基因存在多个位点的基因多态性，与颈部的鳞状细胞癌、室间隔缺损、精神分裂症、抑郁症、扩张性心肌病发生的关系是目前研究热点［4～7］。Nogo-C 是RTN4家族中重要成员之一，在3'-非翻译区存在rs17046518 G/A单核苷酸多态性。目前，有关Nogo-C基因rs17046518 G/A多态性的研究国内外尚未见文献报道。2011年1～12月，我们采用单碱基延伸PCR技术研究了广西地区健康人群Nogo-C基因3'-非翻译区单核苷酸多态性，并与人类基因组计划(Hapmap)公布的四个人群(欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人)的单核苷酸多态性(SNP)分型数据进行比较，旨在探讨Nogo-C基因3'-非翻译区基因多态性在不同种族正常人群中的分布差异，为人类学及群体遗传学研究提供前瞻性基础资料。

1 资料与方法

1.1 研究对象 随机选取广西地区无血缘关系的个体199例，其中男118例，女81例;年龄25～86岁。均为广西右江民族医学院附属医院体检健康者，各项临床及实验室检查指标均正常。

1.2 Nogo-C基因型检测 采集受检者静脉血2 mL，用EDTA-K2抗凝;采用改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA，－70℃保存备用。采用单碱基延伸PCR技术检测Nogo-C基因3'-非翻译区rs17046518 G/A位点多态性的分布:根据 Nogo-C基因rs17046518 G/A位点多态性与已知的DNA序列设计PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特异性扩增Nogo-C基因包含rs17046518 G/A位点碱基的DNA片段的引物，上游引物序列:5'-AGGGGTGTGGGGAGGAGTGACA-3'，下 游 引 物 序列:5'-GGGGGTGGCATGAAACACAATGA-3'，延伸引物:5'-GGGGGGTCGATGTGAGGCAGGTAGGAAGAA-3'。Nogo-C的PCR扩增反应体系为20μL，其中含10 × PCR 缓冲液 2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至20μL。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，PCR产物经虾碱酶(SAP)(from Promega)和外切酶I(EXO I)(from Epicentre)纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用SAP纯化后在ABI3130XL上样。SNP分型用 GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)分析。将Nogo-C基因rs17046518 G/A多态性分布频率与人类基因组计划 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)公布的四个人群(欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人)的SNP分型数据进行比较。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5软件包进行分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PCR扩增产物片段大小为 247 bp。经ABI3130XL基因检测仪SNP分型结果显示rs17046518 G/A位点检测到AA、GA和GG三种基因型。基因测序进一步证实该结果(图1)。Nogo-C基因rs17046518 G/A位点的基因型及等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡，即所选的研究样本具有群体代表性。其中rs17046518 G/A位点基因型以AA型最为常见，占69.8%;其等位基因以A型频率最高，占82.4%。其基因型及等位基因频率分布在男女性别间比较无显著性差异 (表1)。Nogo-C基因多态性基因型及等位基因的分布频率与欧洲人和非洲人比较差异均有显著性(P均＜0.05)，而与日本东京人和中国北京人比较差异无显著性(表2)。

图1 Nogo-C基因rs17046518 G/A测序图

表1 Nogo-C基因型及等位基因频率在广西地区人群中的分布

表2 不同种族及地区人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多态性分布频率比较

3 讨论

Nogo是在中枢神经系统髓磷脂中发现的一种抑制轴突生长的蛋白，编码Nogo蛋白的基因被称为Nogo基因。由于启动子和mRNA剪切方式不同，Nogo基因能表达出3种mRNA的转录体，其编码的蛋白质分别为Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，三者均属于网状蛋白(Reticulon protein，RTN)家族第四成员［2］。Nogo-C相对分子质量最小，由199个氨基酸残基组成，在中枢神经系统中主要分布于星形胶质细胞，外周组织中大部分存在于骨骼肌细胞及脂肪细胞，心脏中亦有少量分布，在抑制神经再生、介导细胞凋亡及参与肿瘤发生等过程中起重要作用［8～10］。Nogo-C 基因位于 2 号染色体短臂上(2p13-14)，编码基因为 RTN4［3］，由 7 个外显子和 6个内含子组成，Nogo-C基因 3'-非翻译区存在rs17046518 G/A单核苷酸多态性，这种基因多态性的存在可能影响Nogo-C基因功能，进而可能影响到Nogo-C基因多态性与相关疾病的发生发展。因此，正确分析和阐明Nogo-C基因多态性在不同种族和地域人群中的分布特点，可为进一步研究不同人群中Nogo-C基因多态性与某些疾病发生发展间的关系提供理论依据和分子遗传学基础。

本研究发现，rs17046518 G/A位点表现出AA、GA和GG 3种基因型，以AA型最为常见，其等位基因以A最为常见。进一步分析发现Nogo-C基因rs17046518 G/A位点基因型及等位基因分布频率在男女组间比较无显著性差异，提示该位点基因型及等位基因分布频率可能与性别无相关性。比较分析发现，我国广西健康人群中 Nogo-C基因rs17046518 G/A位点G等位基因频率显著高于欧洲人和非洲人;与日本人和中国北京人群比较差异无显著性，提示Nogo-C基因型分布及等位基因频率在不同种族间存在明显差异，这一结果符合遗传学规律，即亲缘关系越近，其基因型分布越相似，反之则差异越显著。

综上所述，中国广西人群 Nogo-C基因rs17046518 G/A位点表现出AA、GA和GG 3种基因型，以AA型最为常见，其等位基因以A最为常见，与性别无相关性。Nogo-C基因型分布及等位基因频率在不同种族间存在明显差异，符合遗传学规律。对中国广西人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多态性研究不仅有利于认识临床与Nogo-C基因相关的多种疾病在不同种族和地域表现出来的差异，而且为进一步人类学及群体遗传学的研究和基因多态性普查奠定了基础，并为进行疾病前瞻性研究提供了重要的分子遗传学数据。

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