祛痰除湿剂对离体培养的骨关节炎患者膝关节软骨细胞 TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA 表达的影响

孟祥奇，黄桂成

(南京中医药大学，南京215000)

骨关节炎是一类与年龄相关的退变性疾病，在软骨再生和修复过程中失去动态平衡、关节炎症及机械负重等因素均会加重病情［1～3］，治疗棘手 。2011年3～10月，我们观察了祛痰除湿剂对膝关节软骨细胞 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表达的影响，旨在探讨祛痰除湿剂在骨关节炎治疗中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF雄性10周龄SD大鼠30只，体质量约300 g。培养箱(Espec BNA-31 1型)、倒置显微镜(Olympus U-RFCT50)、恒温摇箱、低温离心机(LXJ-1I型，上海医疗机械三厂)、Rotor Gene 3000型四通道PCR仪(澳大利亚Cobett公司);Mastercycler Personal型基因扩增仪(德国Eppendorf公司)。0.25%胰蛋白酶(Promega公司)、高糖DMEM(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青公司)、TRizol试剂(美国Sigma公司);逆转录酶(北京天根生化科技有限公司);15份行人工膝关节置换术患者的病变膝关节软骨组织标本(均用手术尖刀片削取关节表面软骨，放入盛有PBS的培养皿中，清除表面血污及附着的其他组织)。IL-1、IL-6、TNF-α引物及内参照 βactin引物序列(华大基因生物技术有限公司)。

1.2 含药血清制备 将大鼠随机分为对照组与给药组各15只，分别制备空白生理盐水(NS)血清和含药血清。按体表面积折算动物的等效剂量，配成溶液，给药组予祛痰除湿剂(含制南星、制川乌、薏苡仁、刺五加、丹参、地龙等中药)2 mL/kg灌胃，对照组以生理盐水2 mL/kg灌胃，均2次/d，连续3 d。末次灌胃1 h后分别采集两组腹总动脉血，静置1 h，2 000 r/min离心10 min，抽取血清，56 ℃水浴灭活30 min，经0.22μm滤膜抽滤除菌，分装，－20℃保存备用。

1.3 软骨细胞分离培养 参照文献［5］，用含青霉素钠/庆大霉素双抗液的PBS冲洗膝关节软骨组织标本数次，移入超净台，将软骨组织剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm，均匀敷贴于半径为5 cm培养皿底壁上，其中组织块约占培养皿底1/3面积，加入DMEM培养基(含青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L，20%胎牛血清)，置于37℃，体积分数5%CO2的培养箱中培养。开始第4～5天组织贴壁后换液，以后隔天换液，第15～20天可见少量梭形、短梭形细胞散在分布于组织块周围，25 d左右可见细胞自融，1个月左右细胞长满大部分(70% ～80%)培养皿底壁后弃旧培养液，用消毒无菌镊子移除组织块(组织块可继续加入20%胎牛血清的DMEM培养基，培养原代细胞)，用PBS液清洗3次，加入适量的0.25%胰蛋白酶，室温下振荡2～5 min。镜下观察贴壁细胞逐渐脱落，变成圆形，个别细胞开始浮游，加入新培养液，吹打混匀，离心1 000 r/min，5 min，收集细胞，接种培养，按1∶2比例传代，于37℃、5%CO2培养箱继续培养。

1.4 含药血清干预及 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表达测定 取第三代传代软骨细胞等量置于6孔板中并分为 A、B、C、D、E、F、G 组。A 组加入 DMEM，B组加入5%祛痰除湿剂血清，C组加入5%NS血清，D组加入10%祛痰除湿剂血清，E组加入10%NS血清，F组加入20%祛痰除湿剂血清，G组加入20%NS 血清，继续培养。分别于 4、8、24、48、72 h五个时间点采用Real Time-PCR法检测IL-1、IL-6、TNF-αmRNA表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，计量数据以¯x±s表示，行方差齐性检验，多组样本间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

各组不同时间点软骨细胞 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表达分别见表1、表2、表3。

表2 各组不同时间点软骨细胞IL-6 mRNA表达(¯x±s)

表3 各组不同时间点软骨细胞TNF-αmRNA表达(¯x±s)

3 讨论

骨关节炎是一种以关节软骨退行性改变为中心，累及关节及关节其他结构的慢性炎症。鉴于关节软骨退变是骨关节炎的最直接原因，故目前对骨关节炎的实验研究多集中于对关节软骨退变的研究上。目前骨关节炎的发病机理仍不十分清楚。研究发现，肥胖、运动不当、气候不佳和不良的生活习惯等外界因素，内分泌紊乱，损伤，免疫学异常，细胞凋亡，细胞因子及酶的作用等均可引发关节软骨退变［4］。

近年来发现，关节滑膜细胞及软骨细胞自身在受到不同刺激出现损伤或炎症时，可产生大量细胞因子，其中IL-1、IL-6、TNF-α 等均为炎性因子，不仅能促进单核巨噬细胞与粒细胞吞噬趋化，释放溶酶体酶、氧自由基、组胺等，导致软骨基质降解，还可诱导T细胞和B细胞活化，加重免疫损伤［6］。Goldring等［7］发现，IL-1、IL-6、TNF-α 在软骨及滑膜中表达增高与炎症破坏及炎症反应的严重程度呈正相关。据报道，膝骨关节炎患者血清中 IL-1、IL-6、TNF-α明显升高。IL-6可增加滑膜组织的炎症细胞、刺激软骨细胞增殖，诱导放大IL-1，增加MMPs的合成作用，抑制蛋白多糖产生，但由于IL-6能诱导TIMP的产生，而不是MMPs，故此因子被认为与限制蛋白分解损伤的负反馈机制有关。TNF-α导致关节病变的可能机制是:①刺激滑膜细胞与软骨细胞合成PGE2和胶原酶，刺激血管扩张渗出，促进破骨细胞的溶骨作用，造成关节破坏;②促进软骨细胞合成与分泌MMPs，引起软骨的吸收降解破坏，促使成纤维细胞增生;③对创伤局部血管内皮细胞发挥多方面的作用，包括激活和损伤作用，血管内皮细胞经TNF-α刺激后，可产生形态和功能变化，使其通透性增加，加重局部组织炎性水肿和炎性细胞浸润。

骨关节炎的中医病机辨证是“气虚血瘀，本虚标实，痰湿阻滞”。祛痰除湿剂由制南星、丹参、薏苡仁等中药组成，由经典成药小活络丹化裁而来。制南星燥湿化痰，祛风止痉，还具有散结消肿的作用;薏苡仁可利水渗湿，健脾除痹。对细胞免疫、体液免疫有促进作用，还能降血钙、延缓衰老，提高机体的免疫能力;制川乌能祛除寒湿，温经止痛;刺五加祛风湿，强筋骨，还能利水肿。现代医学研究表明丹参具有活血祛瘀，凉血消痈，除烦安神作用，其有效成分丹参酮等能抑制血小板黏附聚集和血栓形成，降低血液黏度和骨内高压，提高关节软骨超氧化物歧化酶活性，从而能更有效地清除氧自由基，延缓关节软骨的退行性变等作用。可见祛痰除湿剂是通过多系统和多靶点发挥治疗作用。本研究结果表明，采用祛痰除湿剂含药血清干预后，退变软骨细胞中 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表达均下调，以 10%祛痰除湿剂含药血清作用最明显，IL-1、IL-6、TNF-α mRNA分别于10%祛痰除湿剂含药血清作用8、24、48 h后降至最低。据报道，中药复方血清药理实验中体外培养液中的含药血清浓度以临床等效剂量为基准，其中10%较为合适，一般不超过20%，过高或过低均不宜［8］。本研究为探索性实验，结果显示以10%含药血清浓度效果最好，与文献［8］报道一致，此为祛痰除湿剂临床等效剂量治疗骨关节炎提供了可靠实验依据。

本研究结果提示，10%祛痰除湿剂含药血清可能通过影响膝关节软骨中IL-1、IL-6、TNF-α及相关代谢酶mRNA表达而及减轻炎症反应，延缓关节软骨细胞的退变。但本实验由于受实验条件和技术水平限制，且正常人的软骨组织取材较困难，故缺乏正常的关节软骨细胞作对照，具体的作用机制尚有待进一步深入研究。

［1］ Goldring MB，Goldring SR.Osteoarthritis［J］.J Cell Physiol，2007，213(3):626-634.

［2］Goldring MB，Marcu KB.Cartilage homeostasis in health and rheumatic diseases［J］.Arthritis Res Ther，2009，11(3):224.

［3］Miyaki S，Sato T，Inoue A，et al.MicroRNA-140 plays dual roles in both cartilage development and homeostasis［J］.Genes Dev，2010，24(11):1173-1185.

［4］Kurz B，Lemke AK，Fay J，et al.Pathomechanisms of cartilage destruction by mechanical injury［J］.Ann Anat，2005，187(5-6):473-485.

［5］Sanchez C，Deberg MA，Bellahcene A，et al.Phenotypic characterization of osteoblasts from the sclerotic zones of osteoarthritic subchondral bone［J］.Arthritis Rheum，2008，58(2):442-455.

［6］郭军华，施桂英.透明质酸钠治疗膝骨性关节炎的疗效观察［J］.中华内科杂志，2004，4(4):136.

［7］Goldring MB.The role of cytokines as infliammatory mediators in osteoarthritis:lessons from animal models［J］.Connect Tissue Res，1999，40(1):1-11.

［8］李振光，王净净.关于中药血清药理学方法的思考［J］.中国中医药信息杂志，2002，9(2):5-6.