表皮生长因子对CacyBP/SIP过表达慢病毒载体转染的结肠癌细胞CacyBP/SIP核转位的影响

谢福利，翟惠虹

(1宁夏师范学院医学院，宁夏固原756000;2宁夏医科大学总医院)

据报道［1～4］，钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)核转位在肿瘤发生、发展、侵袭、转移等方面均起促进作用，但机理目前尚不明确。有报道，表皮生长因子在结肠癌组织、癌周组织、癌远侧组织均有表达［5，6］，且随肿瘤分期增加而表达增强，用其单克隆抗体处理LST174结肠癌细胞可见到一定程度的增殖抑制［7］。2010年7月～2011年9月，我们观察了表皮生长因子对CacyBP/SIP过表达慢病毒载体转染的结肠癌细胞CacyBP/SIP核转位的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 结肠癌SW480细胞购于上海中科院。L15培养基、小牛血清、胰酶购自Gibco公司;DAPI染色剂、表皮生长因子购于Sigma公司、胞质胞核蛋白抽提试剂盒购于Pierce公司;CacyBP/SIP mAb购于Cell signaling;FITC标记的羊抗鼠IgG购自中山公司;Triton x-100裂解液试剂盒购自北京鼎国公司;PVDF膜购自Merck公司。

1.2 过表达CacyBP/SIP慢病毒载体的构建及转染应用人结肠癌细胞株HCT-116的cDNA序列，采用PrimerPremierv5.0软件分别设计上游和下游引物;引物序列及用途见表1。应用PCR法扩增CacyBP/SIPcDNA序列。PCR扩增条件:94℃预变性5min;30次循环:94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1min;72℃总延伸10 min。PCR产物常规测序。带有绿色荧光的慢病毒载体与目的基因分别用NheI和EcoRI进行双酶切，T4连接酶将酶切后的产物相连，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，应用PCR法筛选阳性克隆。PCR扩增条件:94℃预变性2min;30次循环:94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min;72℃总延伸6min。接种阳性转化子。对构建载体的阳性克隆PCR结果电泳鉴定(图1);进行测序与目标基因比对(图2)。

表1 引物序列及用途

图1 阳性克隆PCR电泳注:1:阴性对照(ddH2O);2:阴性对照(空载自连对照组);3:阳性对照(GAPDH);4:Marker:5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp;5～12:CacyBP-1～8号转化子

图2 部分基因测序比对

将构建好的带有绿荧光蛋白的CacyBP-Lentivirus载体转染至结肠癌SW480细胞:将人结肠癌细胞SW480细胞用含10%的56℃、30min热灭活小牛血清的L15培养基，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至80% ～90%传代。至细胞在T50瓶长至30% ～50%时，每瓶加入Polybrene500μL(5μg/mL)、完全培养基4400μL和过表达CacyBP/SIP的慢病毒颗粒100μL(1×108)，在水平方向轻轻摇动培养瓶，使之充分混匀，放入培养箱培养8～12h后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基继续培养。待细胞长至80%以上融合时，正常消化传代。

1.3 表皮生长因子刺激及CacyBP/SIP在细胞内定位和表达检测 ①激光共聚焦显微镜法:取3个12孔培养板，每孔放置一个细胞爬片，每孔接种(3～4)×104个细胞于12孔板。待细胞长至最佳状态时，吸干培养基，用PBS冲洗2次，每个培养板加入2mL含100ng/mL表皮生长因子培养基，对照组每孔分别加入完全培养基作为对照。放入培养箱培养1h。用4%多聚甲醛1mL，固定20min，PBS冲洗3遍，再用0.1%的 Tritont100，37℃温箱内打孔45 min，PBS冲洗3遍，最后用含DAPI封片剂染色封片。观察刺激前后CacyBP/SIP在细胞中的定位。②Westernblot法:将转染后的SW480细胞予100 ng/mL表皮生长因子刺激1h，胰酶消化后以500转离心3min，取细胞沉淀用细胞质蛋白、核蛋白抽提试剂盒分别抽提胞质、胞核蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量;上样缓冲液稀释至5μg/μL、煮沸后－80℃冻存;将20μL蛋白样品上样到12%SDSPAGE胶加样孔内，电泳电压80V，时间20min;湿式转膜，电流200mA，60min;加入5%脱脂牛奶封闭60min后，加入CacyBP/SIP单抗(1∶200)4℃孵育过夜，常规洗膜后加入羊抗鼠IgG(1∶2000)的二抗，室温孵育1h，洗涤。曝光、显影。检测刺激前后CacyBP/SIP在细胞中的定位。

2 结果

激光共聚焦检测结果显示表皮生长因子刺激前CacyBP/SIP主要位于细胞胞质内，刺激1h后CacyBP/SIP转位至细胞核内(图3)。Westernblot检测结果显示刺激前CacyBP/SIP主要在胞质内表达，刺激1h后可在细胞核内表达(图4)。

3 讨论

图3 激光共聚焦法检测表皮生长因子刺激前、后CacyBP/SIP在细胞内定位

图4 Western blot检测表皮生长因子刺激前、后CacyBP/SIP在细胞质及细胞核中的表达

CacyBP/SIP相对分子质量约为26kD，含一个687bp的开放阅读框，编码228个氨基酸，存在7个磷酸化位点和1个核定位信号［8］。CacyBP/SIP的C-末端可形成两性α-螺旋，与S100蛋白家族的结构域相似，C-末端(155-229)为S100蛋白结合域，N-末端(1-80)可与Siah-1结合，中间(73-155)即可与Skp1结合的区域［9］。目前对CacyBP/SIP功能的研究报道较少，其功能主要表现在以下两方面:①与红细胞有关:据报道［10，11］，促红细胞生成素受体活化可促进CacyBP/SIP表达上调;②与p53有关:参与新的泛素—蛋白酶体降解，当p53在细胞内表达升高时，可诱导Siah-1基因表达［12］，共同组成泛素连接酶复合体 (Siah-1-CacyBP/SIP-SCF)，将未被磷酸化的β-catenin蛋白酶体降解。

以往研究发现，CacyBP/SIP在胃癌阿霉素耐药细胞中高表达并参与胃癌细胞多药耐药，其下调可以部分逆转耐药性［13，14］。进一步研究发现，CacyBP/SIP可抑制胃癌细胞的恶性表型，下调其表达能促进胃癌细胞的恶性表型，推测其通过促进癌细胞的凋亡和参与降解β-catenin影响靶分子的表达。但在肾细胞癌中发现，CacyBP/SIP表达上调能抑制肾细胞癌的增殖和肿瘤形成［15］。近年来又发现CacyBP/SIP参与乳腺癌、胰腺癌的发生、发展及复发转移，可能成为预后不良的生物学指标之一［16～19］。因此推断CacyBP/SIP与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。本课题组前期采用淋巴细胞杂交瘤技术制备了三株CacyBP/SIP单克隆抗体，对正常及肿瘤组织中CacyBP/SIP表达分布状况做了较系统的研究［20，21］，发现 CacyBP/SIP 在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，在正常结肠组织不表达，且主要定位于胞质及胞核;予KCl刺激后，通过升高胞质内Ca2+浓度，可诱导CacyBP/SIP核转位。

表皮生长因子是1962年美国Cohen博士在实验中偶然发现，是一类广泛存在于人类和动物体内的小分子多肽，不同种类动物的EGF氨基酸组成及结构有一定差异，不同来源的表皮生长因子均能促进表皮细胞的分裂与增殖［22］，与肿瘤的发生、发展关系密切。其基因在第4号染色体上(q25-q27)，约有 120 kb［23］，等电点(PI)为 4.6，相对分子质量为6 045 Da，由53个氨基酸残基组成的单链多肽，含3个链内二硫键［24］。有报道新型表皮生长因子受体抑制剂不管是单用还是与放疗、化疗联合，均可提高患者生存率、延长缓解期［25］。

慢病毒载体是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，其基因组是正链RNA，进入细胞后，在细胞质中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞质中，表达目的蛋白。鉴于慢病毒载体具有转染效率高、可稳定长效表达、安全性高、可表达调控等优点，我们构建了CacyBP/SIP过表达慢病毒载体并将其转染至结肠癌SW480细胞。激光共聚焦法及Western blot法均发现表皮生长因子刺激前CacyBP/SIP均主要定位于细胞胞质，刺激后CacyBP/SIP可发生核转位现象，Western blot检测亦证实CacyBP/SIP在刺激前位于胞质，刺激后部分位于胞核。

蛋白在细胞中的定位常与其功能密切相关，很多蛋白分子从无活性形式变为活性形式时会发生分子定位的变化，进入到特定的亚细胞结构中发挥其功能，其核转位现象提示其可能作为信号分子传递信息，从而参与细胞功能的调节。我们前期已发现CacyBP/SIP在结肠癌组织中高表达，免疫组化结果提示CacyBP/SIP位于胞质及胞核，表皮生长因子可诱导CacyBP/SIP核转位，关于CacyBP/SIP是否作为信使传递上游促进恶性肿瘤增殖的信号，尚需进一步研究。

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