提高脑组织冰冻切片质量的几点体会①

李 慧 黄景阳 袁中瑞 (山东大学医学院病理生理学教研室，济南250012)

冰冻切片因操作简便、快捷、环境污染小(无须用二甲苯处理)，组织抗原损伤小而被许多临床和科研工作者所应用[1]，但冰冻切片主要有两个问题，第一:冰冻切片比较容易脱片，给后续免疫组化过程带来了很大的麻烦与不便。脱片是指组织从载玻片上脱下或组织已与载玻片分离，悬浮但尚未脱下。载玻片的处理方式及操作者切片的熟练程度等都能影响冰冻切片的脱片情况，这些因素会使冰冻切片在免疫组织化学染色过程中脱片不一，切片可能只是边缘轻度卷曲，也可能是不同面积的脱落甚至是完全脱片;第二:冰冻切片是否需要抗原修复的问题至今尚无定论，这两点使冰冻切片的染色质量、结果准确性下降，因此造成最终实验结果可比性差。为保证实验的正确性和科学的严谨性，冰冻切片的脱片情况和是否需要抗原修复的问题急需解决。脑组织冰冻切片使用率高，众多处理方法更是值得推敲，但是脑组织冰冻切片的脱片情况并没有完全解决，本文将现有的脑组织冰冻切片技术结合自己在脑组织切片过程中所遇到的问题进行探讨，主要从载玻片处理、组织灌流固定、脑组织冰冻切片、免疫组织化学染色四个部分探讨在保证实验真实性和科学性的前提下，提高免疫组织化学染色结果的准确性。

1 载玻片处理过程注意事项

在临床病理诊断和鉴别诊断中，比如说对于外科切下的肿瘤等，D'Halluin等[2]将乳腺肿瘤的边缘组织冰冻切片后直接贴在普通载玻片上，快速检测组织的良恶性后，将信息反馈给外科大夫来指导下一步手术，这样的方法被部分临床病理诊断所使用，其操作时间短并且步骤简单，所以不易出现组织脱片情况，但是这种方法不能普遍应用于全部基础实验和临床病理诊断中，不处理的玻片直接使用，组织脱片情况非常严重，甚至会造成研究的中断，而直接购买已经处理过的玻片不仅价格昂贵，而且处理效果不一致，所以多数研究人员选择自己处理玻片。

1.1 溶液配制 现用于免疫组化染色的防脱片剂有多种类型，如明胶、多聚赖氨酸、乳白胶、APES(氨醛三已氧基硅烷)、蛋白甘油、试剂公司提供的切片等等[3，4]，其中以明胶和多聚赖氨酸的使用率最高。多聚赖氨酸价格昂贵，不适合大批量使用，会给实验工作人员带来不必要的经济负担。使用相同的防脱片剂但是使用不同的处理方法，如只单纯改变防脱片剂的涂片次数来处理载玻片，也会使后续免疫组化过程中组织脱片情况不同[5]。我们在实验过程中将于德钦等[3]的方法略做改进后来处理玻片，具体方法如下:①称取明胶2.5 g，溶于500 ml蒸馏水中，水浴箱加热溶解。此过程中水浴箱温度设定不超过60℃，因明胶本身为一种蛋白质，不采用水浴加热则不易溶解，若采用微波等方法加热，温度则不易控制，很容易导致明胶失活和涂片不均匀。②明胶完全溶解后向上述溶液加入0.25 g硫酸铬钾(别称铬明矾)。因硫酸铬钾密度较大，溶解后容易沉在全部溶液的下半部分，用时需混匀，因加入的硫酸铬钾较少，此问题易被忽视，故在硫酸铬钾溶解过程中，可吹打溶液促溶硫酸铬钾，这样亦可起到混匀溶液的作用，溶液配制完成后室温放置。明胶硫酸铬钾溶液使用期限最好不超过一周，因为明胶为一种蛋白质，放置较长时间后该溶液易长菌变质，溶液霉变或溶液由淡黑绿色变成褐色时严禁使用。在处理玻片前应仔细观察溶液是否霉变(霉变后有絮状物)、是否变色，一般只需注意在处理玻片时，保证玻片干净无水，不将该溶液稀释，并在该溶液不变质的情况下可以连续使用。

1.2 玻片处理 将新购未处理的载玻片摆置在干净的玻片架上，在蒸馏水中冲洗数秒，目的是除去玻片生产过程中的粉尘及空气中飘粘上的毛絮，60℃烤箱中烤干或密封箱子内凉干玻片上的蒸馏水，此为保证玻片干净和明胶硫酸铬钾溶液不被稀释。将上述处理好的玻片浸入配好的明胶硫酸铬钾溶液中30秒，其间可轻轻摆动玻片架，使玻片涂抹均匀，室温凉干玻片，放于60℃烤箱中烤12～24小时，该过程注意载玻片须控尽液体或室温完全晾干后才可置入烤箱中烤干备用。

2 灌流固定过程注意事项

2.1 灌流固定原理 组织固定的原理主要是在不影响酶、抗原活性的情况下固定液快速渗入组织内，使蛋白质快速凝固，阻断细胞的新陈代谢，而对糖原、核酸和碳水化合物起到保护作用。常用的冰冻切片的固定液有6种:95%酒精、4%甲醛、甲醇、丙酮、EAF固定液、AAF固定液。邱前程等[6]认为对于多数抗体而言，EAF固定液的固定效果要优于其他固定液，但是个人认为不同的固定液固定组织有不同的原理，绝不可一概而论。95%酒精穿透性强，可使蛋白质变性而固定组织，兼有脱水的作用;4%多聚甲醛与10%福尔马林作用原理类似，主要是与组织内的氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键，使蛋白质相互交联而固定组织;甲醇的机理主要是使蛋白质变性;丙酮渗透力强，使蛋白质沉淀，其多用来固定细胞而很少用于固定组织;EAF、AAF主要为几种单纯固定液的混合液配合缓冲液组成，并且加入冰醋酸以促染色，所以此二者虽然可以应用于多数组织的固定，但由于不同组织组成成份(蛋白质、脂肪、核酸、糖原等的构成比例)不同，使用这两种固定液的固定效果也不同，不可一概而论。不同的固定液都有不一样的优缺点，需要根据自己实际过程中所用的组织，后续不同的需要来选择不同的固定液。

2.2 灌流固定方法 高永强等[7]认为在脑组织冰冻切片时，4%多聚甲醛心脏灌流固定的效果优于其他方法，我们在实验过程中将此方法进行改进:①多聚甲醛固体不易溶解，用1×PBS配制的多聚甲醛溶解后，用约90 μm孔径的定性滤纸过滤溶液，以减少在后续免疫荧光染色中因多聚甲醛颗粒造成的非特异发光。②多聚甲醛配制完成后，4℃保存，此时多聚甲醛挥发少，并可被提前预冷，使灌流固定效果优良[8，9]，1周之内用完。③NS 置换血液和多聚甲醛灌流固定组织时，灌流管中都不应有气泡，否则会造成空气栓塞，影响灌流固定效果。④NS灌流置换血液时，灌流管的长度不宜过长，1 m的高度即可，否则由于NS的重力和灌流速度过快会使灌流液体的压力过大，造成微小血管破裂而影响灌流效果。⑤李晶晶等[10]认为多聚甲醛灌流固定时速度先快后慢的方式可以提高组织固定效果。我们在实际实验中用三通管来操作，将用来灌流的尖端磨平的针头从大鼠左心尖插入大鼠主动脉根部，固定针头后开始NS灌流，待流出的NS的灌流液澄清后说明动物体内的血液基本被完全置换，在用三通管换成多聚甲醛灌流固定前，事先用100 ml的注射器(不带针)抽取大约60 ml 4%多聚甲醛，待 NS将血液置换完全后，将连接多聚甲醛用来灌流固定的输液器从药液过滤器与输液针(灌流固定针)之间的连接件处分开输液器，将100 ml的注射器与输液针相连，把事先抽好的60 ml 4%多聚甲醛快速推注动物体内，之后分开注射器与输液针，再将连接多聚甲醛的输液器从药液过滤器处与输液针连接，之后滴注多聚甲醛约1小时。该过程需保证NS将动物体内的血液全部置换后，方可用多聚甲醛固定，否则残存的红细胞会造成非特异染色，从而影响免疫组化染色结果的准确性;还需保证多聚甲醛的灌流速度先快后慢，这样组织固定效果优良。取出脑组织后将脑组织浸泡在4%多聚甲醛中，4℃过夜。组织固定完成后，将组织在4℃冰箱用20%、30%的蔗糖梯度脱水，待组织块沉底后取出。组织脱水所用的蔗糖溶液的体积须大于所脱水组织体积的5倍才可达到比较好的脱水效果，蔗糖溶液体积过小会使脱水不充分，导致切片时产生数目较多、体积较大的冰晶，最终表现在免疫组化染色图片上则是无数空洞，从而影响免疫组化染色结果的准确性。

3 切片过程注意事项

3.1 冰晶问题 切片时要防止冰晶产生，冰晶是由脑组织脱水后残存的水分子结冰形成[1]。从水的物理性质中可以看出，水在-4℃时体积最大，这意味组织在-4℃停留时间越长，组织内产生的冰晶体积越大、数量越多，因此要最短时间内使组织温度降至-4℃以下。水、脂肪和蛋白质的物理性质决定了在温度同时下降时，水最容易从液体状态转化为固体状态，即在脑组织中结冰成冰晶，冰晶质地硬，若此时脑组织内的主要成份脂肪和蛋白质因没有完全冻结而质地较软，冰晶形成后便会挤压冰晶周围组织，使组织受压变形，所以必须使脑组织快速降温，保证水、脂肪和蛋白质都在最短的时间内充分冻结。在免疫组织化学染色中，冰晶可以融化，但脑组织受压变形后却不能恢复，此时便会在脑组织冰冻切片上形成大小不一的间隙，表现在免疫组化染色图片则是一个个大小形态不一的空洞。免疫荧光染色的目的主要是观察荧光的亮度与强度，背景色一般为黑色，空洞在背景中因色暗而容易被忽视;而用DAB显色的免疫组化图片背景色一般为无色透明或浅色，此时在图片上便会有无数空洞，常影响实验结果的观察和分析[11]，所以在脑组织冰冻切片时要注意速冻脑组织。包翠芬等[1]认为用液氮骤冷法来速冻脑组织效果好，但是该方法在具体操作时，要注意液氮的使用方式，否则会使脑组织因冰冻不均匀而破裂，可以在脑组织周围裹适量OTC胶后，再在样品上浇液氮或者将样品连带样品托放入液氮中，这样既可防止脑组织因冰冻不均而产生裂痕又可达到较好的速冻效果。

3.2 包埋 包埋时要尽量防止气泡产生，包埋时存在气泡会造成包埋不均匀，在切片时因气泡与OTC胶质地不同，所切的脑片容易从气泡周围开始卷曲;包埋后须把OTC胶修成长方形、正方形或是梯形，保证所切的脑片周边没有小的尖刺，切片周边小的尖刺或切片形状不规则都容易使切片从这些不规则的地方开始卷曲。

3.3 固定样品托与切片 牢固固定样品托，虽然现在冰冻切片机结构良好，但是这个问题容易被操作者忽视，若样品托固定不牢固或有转动的情况，由于脑组织重力和刀片的相互作用会使切片成弧形而造成贴片不完全，切片时要先慢后快，先慢为使刀片切力小，使脑片不容易卷曲，后快为使所切的脑片远离刀片边缘，使得贴片容易。组织标本最好一次性切完，因组织抗原通常是一种蛋白质，反复冻溶组织会损伤组织抗原;而且被反复冻融的组织会变脆甚至性状发生改变，从而使切片和贴片困难，使组织更易出现脱片情况。

3.4 贴片 可在载玻片上滴3 μl左右的PBS后贴片，以所滴的PBS为起点轻轻沾起脑片，该过程要防止气泡产生，个人认为数目不多且直径小于1 mm的气泡对后续DAB显色的普通免疫组化和免疫荧光结果影响不大;大的气泡可以用软毛笔将其戳破，对后续实验几乎无影响。

3.5 储存 贴片完成后，需室温待载玻片上的PBS凉干后，将脑切片放入-80℃冰箱中备用，否则残留的PBS会在玻片与脑片间结冰，导致免疫组化过程中易出现脱片现象。刚刚切好的冰冻切片不宜马上作免疫组化，容易出现脱片，可能是因为明胶这种蛋白质与硫酸铬钾形成的胶状混合物涂在载玻片上后，再与富含脂肪的脑片黏合需要一定的时间，切片完成后放于-80℃冰箱2至3天后，待脑片与玻片黏合充分后，再做免疫组化则不易出现脱片。切片放置时间不宜超过一个月，否则会影响冰冻切片上的抗原。

4 免疫组织化学染色过程注意事项

4.1 是否需要抗原修复的问题 目前认为影响抗原修复的两个基本因素是:抗原修复温度和修复液的pH值，抗原修复技术的发明主要归功于生物化学家对蛋白质与甲醛化学反应的深入研究[12]。杜鹃等[13]用10%的中性多聚甲醛固定前列腺癌、良性前列腺增生、乳腺增生组织和人乳头状瘤病毒感染的外阴上皮组织，之后研究 P504S、P63、CD10、Ki-67抗原在不同的温度和PH溶液中的修复情况，发现不同的抗原有不同的修复条件。因为蛋白质分子与甲醛反应的复杂性，故难以找到一种适合所有组织抗原修复的方法，而抗原修复的主要机制是打开甲醛与蛋白质分子形成的交联物。以前认为冰冻切片进行免疫组织化学染色时不需要抗原修复，现多数实验人员也没有将抗原修复技术应用于冰冻切片，但是Yamashita等[14]将抗原修复技术应用于甲醛固定的新鲜组织的冰冻切片，获得了优良的免疫组织化学染色;李娟娟等[15]认为用福尔马林固定大鼠脑组织进行冰冻切片时，许多抗原决定簇会被醛基交联封闭，其采用高温高压的方法修复抗原，效果良好;于彬等[16]将微波修复法应用于脑组织冰冻切片的抗原修复，效果亦良好;Krenacs等[17]发现在合适的缓冲液中，用大于95℃的湿热修复法能打开在福尔马林固定过程中产生的蛋白质醛基交联，重塑组织抗原表位的原有结构;Hasui等[18]用热修复抗原法对成人外周血单核细胞的p53蛋白进行免疫组织化学染色，染色效果亦较好。由于蛋白质分子与甲醛反应的复杂性，所以不同抗原的修复方法也各异，这就给实验造成了一定难度，并且抗原修复会不会产生假阳性结果的问题至今尚无定论。个人认为在具体的实验过程中若怀疑有假阳性结果，必要的情况下可以选择阴性对照和阳性对照同时做免疫组化，以此也可确定是否因抗体造成的实验结假阳性;再者实验前需就靶抗原进行基本了解，确定其核浆表达情况等也有助于判断实验结果是否假阳性。我们在实验过程中采用4%多聚甲醛心脏灌流固定，因多聚甲醛较10%福尔马林性温和，在免疫组织化学染色时未进行抗原修复，我们在排除了假阳性情况后，也得到了预期的阳性结果，所以在实验中不管冰冻切片修复与否，及不管采用什么样的修复方式，在同一个实验前后最重要的是保证实验条件的一致性，以便进行实验结果比较，这样才能保证实验的科学性、严谨性和真实性。

4.2 洗片 脑组织冰冻切片洗片过程动作要轻柔，不宜用移液管或移液枪正对脑片直接冲洗，如果脑片贴片时有空泡或切片周边有轻微脱片，直接冲洗易造成整个脑片脱片。操作时可从脑片周边的载玻片开始冲洗，或者用载玻片立式缸浸泡玻片，我们实验中采用:立式缸内，1×PBS/TBST浸泡脑片20分钟×3次的洗涤方法取代传统摇床洗涤5分钟×3次的洗涤方法，浸泡期间时常晃动立式缸即可，此法起到了优良的洗涤效果，有效得避免了组织脱片，提高了实验的准确性。

石蜡切片虽然容易操作并且储存方便，但由于石蜡切片对组织结构和抗原损伤破坏大，组织抗原性下降，使石蜡切片在一些分子生物学实验方面(如研究组织表面抗原和细胞分泌蛋白等)受到限制[19]，石蜡切片会用到二甲苯，二甲苯对环境污染严重，并会损害实验人员身体健康，冰冻切片的这些问题则很少。冰冻切片的主要问题是脱片和抗原修复问题，故本文从明胶硫酸铬钾处理载玻片、脑组织灌流固定、脑组织冰冻切片、免疫组织化学染色等四大部分探讨如何减少脑组织冰冻切片脱片;如何提高脑组织冰冻切片免疫组化染色结果的准确性。我们结合现有的脑组织冰冻切片技术和我们在实验过程中的不断总结，选择了廉价的明胶来处理载玻片，减少了脑冰冻切片脱片;预冷的多聚甲醛灌流固定，提高组织灌流固定效果，我们所选的试剂价格低廉，配制方法简捷，用量少，重复性好，并且染色结果准确性高，尤其是明胶处理的载玻片在免疫组化实验中都可使用，尤其适合大批量使用，可在临床和科研实验室中积极推广。

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