HIV/AIDS患者B7-H1的表达与合并机会性感染关系的研究①

谢荣华 欧阳珊珊 (湖南环境生物职业技术学院，衡阳421005)

HIV/AIDS患者存在免疫缺陷，死亡的主要原因是因为免疫缺陷而导致机会性感染，早期预防及发现机会性感染可提高和延长HIV/AIDS患者生命。B7-H1(B7-homolog)是新发现的重要的共刺激分子之一，也称为程序死亡分子1配体-1(Programmed death-1 ligand-l，PD-L1)，B7-H1 主要表达在活化的T淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)、B淋巴细胞和部分肿瘤组织。B7-H1主要和程序死亡分子-1(Progrdeath-1，PD-1)结合传递负调节信号，导致免疫功能降低[1]，Barber等[2]在慢性病毒感染的鼠体内注射B7-H1单克隆抗体，即使在CD4+T淋巴细胞耗竭的情况下，亦能改善特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能，抑制体内病毒载量，改善临床症状。因此，B7-H1在艾滋病免疫发病机制中起着重要作用。我们观察HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表达变化，并探讨其与合并机会性感染的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 为某院2009年1月至2012年5月HIV/AIDS住院患者42例，年龄25～67岁，平均(45±7)岁，其中男25例，女17例，根据HIV/AIDS患者是否合并机会性感染，将HIV/AIDS患者分为HIV/AIDS未合并机会性感染组和合并机会性感染组，所有病例均HIV感染确证试验阳性，符合中华人民共和国HIV/AIDS国家诊断标准[3]，排除自身免疫性疾病等，另选择年龄和性别与病人相匹配的健康对照42名。

1.2 研究方法

1.2.1 HIV/AIDS机会性感染诊断 机会性感染的诊断标准:①确诊为HIV/AIDS患者;②具有相关机会性感染的典型临床症状、体征和辅助检查表现;③临床标本中或组织病理学检查证实病原体存在。符合①②者为临床诊断，符合①②③或①③者为病原学诊断，具体参照2003年美国《成人及青少年HIV感染者机会性感染防治指南》[4]。

1.2.2 主要试剂和仪器 美国BD公司FACSCalibur型流式细胞仪，鼠抗人 Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP均购自美国 BD公司，鼠抗人 B7-H1-PE购自美国eBioscience公司;CD4+T淋巴细胞计数试剂盒为美国BD公司TriTEST三色试剂。bDNA法检测HIV-1 RNA病毒载量，仪器为德国Bayer公司System340 bDNA Analyer，试剂盒为德国Bayer公司3.0检测试剂盒。

1.2.3 Ficoll-Hypaque密度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC) 取新鲜采集的健康人、HIV/AIDS患者静脉EDTA抗凝全血，1 500 r/min离心10分钟，取血浆-80℃冰箱冻存。去除血浆后的血用PBS稀释，充分混匀后，缓慢加至人淋巴细胞分离液液面上，2 500 r/min离心20分钟;取中间白膜层加至另一离心管中，PBS洗涤2次，得到PBMC。

1.2.4 B7-H1表达水平的流式细胞仪分析 密度梯度法分离HIV/AIDS患者及健康对照外周血单个核细胞并计数(PBMC)，应用以下荧光标记的单抗进行染色，Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP、B7-H1-PE并设同型对照，4℃避光染色30分钟，加入2 ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入含1%多聚甲醛的PBS重悬，FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。用 FSC、SSC、CD11C、HLA-DR、Lin1定义mDC(mDC表面特征性标志为CD11chighHLADR+Lin 1-)，分析这一群细胞B7-H1的表达水平。

1.3 统计学分析 应用SPSS11.5软件包进行统计学分析，数据以±s表示，相关性采用pearson相关进行分析，所有检验均取P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HIV/AIDS患者 mDC上 B7-H1表达水平、CD4+T细胞计数及病毒载量(见表1) HIV/AIDS患者合并机会性感染B7-H1表达水平为23.57%±7.24%，未合并机会性感染者，为9.33%±6.02%，健康对照为0.36%±0.12%。HIV/AIDS患者的mDC上B7-H1表达水平均高于健康对照组，显示为合并机会性感染者＞未合并机会性感染者＞健康对照(均P＜0.05)。HIV/AIDS患者合并机会性感染CD4+T细胞计数明显低于未合并机会性感染组(P＜0.05)，未合并机会性感染组明显低于健康对照组(P＜0.05);病毒载量，HIV/AIDS患者合并机会性感染明显高于未合并机会性感染(P＜0.05)，未合并机会性感染明显高于健康对照组(P＜0.05)。

2.2 HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表达水平与CD4+T细胞数量及血浆病毒载量的相关性分析(见图1、2) HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表达水平，与CD4+T细胞数量呈显著负相关(r=-0.665，P＜0.05)，而与血浆病毒的载量呈明显正相关(r=0.604，P ＜0.05)。

2.3 HIV/AIDS患者机会性感染发病率与mDC上B7-H1表达水平的关系(见表2) 对42例HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表达水平进行检测，发现B7-H1表达水平＞30%机会性感染率为100.00%，B7-H1表达水平＜10%机会性感染率为28.57%，两组比较有显著性差异(P＜0.05)，42例 HIV/AIDS患者发生机会性感染31例，总体感染率73.81%，随着B7-H1表达水平升高机会性感染率增高。

表1 42例成人HIV/AIDS患者与健康对照者mDC上B7-H1表达水平、CD4+T细胞数量及病毒载量检测Tab．1 Detection of the level of B7-H1 on mDC ，CD4+T cell absolute counts and plasma viral loads from 42 HIV/AIDS patients and 42 health controls

图1 HIV/AIDS患者B7-H1表达水平与CD4+T细胞数量的相关性Fig．1 Association between level of B7-H1 expression and CD4+T cell counts

图2 HIV/AIDS患者B7-H1表达水平与病毒载量的相关性Fig．2 Association between level of B7-H1 expression and plasma viral loads

3 讨论

HIV/AIDS是一种由HIV侵犯CD4+T细胞受损为主要特征的继发性细胞免疫缺陷性疾病。HIV在增殖过程中通过直接毒性作用、细胞融合、自身免疫等破坏方式杀伤CD，导致免疫功能低下，进而引起各种病原体如弓形虫、卡氏肺孢子虫、结核、霉菌等感染和肿瘤，导致出现各种感染的综合征和临床体征。B7-H1及其受体PD-1属于负性共刺激分子，两者相互作用能够降低T淋巴细胞的免疫功能，同时影响多种Th1和Th2型细胞因子的分泌[5]，如下调IL-2和IFN-γ分泌。最近有多篇关于病毒感染可以诱导B7-H1和PD-1的表达上调的报道。陈良恩研究慢性乙型肝炎患者免疫细胞B7-H1表达上调[6]，从而抑制了 T淋巴细胞的功能。Trabattoni等[7]发现HIV患者外周血淋巴细胞B7-H1表达水平与HIV患者的病情进展有着密切的联系，B7-H1表达水平越高，患者的病情越严重。本研究对42例HIV/AIDS住院患者进行外周血髓样树突细胞(mDC)上B7-H1表达水平检测，同时检测外周血CD4+T细胞数量与病毒载量，结果显示，HIV/AIDS患者的mDC上B7-H1表达水平均明显高于健康对照组，而合并机会性感染者高于未合并机会性感染者，未合并机会性感染者高于健康对照;HIV/AIDS患者合并机会性感染CD4+T细胞计数明显低于未合并机会性感染组，未合并机会性感染组明显低于健康对照组，与国外其他研究者的结论一致[8];病毒载量合并机会性感染者明显高于未合并机会性感染，未合并机会性感染者明显高于健康对照组。HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表达水平，与CD4+T细胞数量呈显著负相关，而与血浆病毒的载量呈明显正相关。42例HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表达水平＞30%机会性感染率为100.00%，B7-H1表达水平＜10%机会性感染率为28.57%，42例HIV/AIDS患者发生机会性感染31例，总体感染率73.81%，随着B7-H1表达水平升高机会性感染率增高。提示B7-H1表达与疾病进展关系密切，是HIV感染疾病进展的标志之一，深入研究B7-H1-PD-1信号途径对HIV感染免疫功能的影响及调节免疫功能的机制，将对理解共刺激分子家族的相互关系及其复杂性具有重要意义，同时也为阐明HIV感染效应T淋巴细胞免疫耐受的可能机制及临床免疫治疗提供新的思路。综上所述，B7-H1、CD4+T细胞计数与机会性感染关系密切，定期监测B7-H1、CD4+T细胞，加强机会性感染的预防，尽可能延长患者的生命和提高患者的生活质量。

表2 HIV/AIDS患者机会性感染发病率与mDC上B7-H1表达水平Tab．2 The relationship between the expression of the B7-H1 on mDC and incidence of opportunistic infection in HIV/AIDS patients

1 Chen L.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J].Nat Rev Immunol，2004;4(5):336-347.

2 Barber D L，Wherry E J，Masopust D et al．Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection [J].Nature，2006;439(7077):682-687.

3 Chinese Medical Association.Chinese Center for Disease Control and Prevention guidelines for diagnosisand treatment of HIV/AIDS in China(2005)[J].Chin Med J，2006;119(19):1589-1608.

4 Benson C A，Kaplan J E，Masur H et al．Treating opportunistic infections among HIV-infectin adults and adolescents:recommendations form CDC，the National Instiutes of Health，and the HIV Medicine Association/Infectious Diseases Society of America[J].MMWR Hocomm Rep，2004;53(RR15):1-112.

5 Salama A D，Chitnis T，Imitola J et al．Critical role of the programmed death-1(PD-1)pathway in regulation of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Exp Med，2003;198(1):71-78.

6 陈良恩，陈威巍，付宝云et al.B7-H1/PD-1共刺激途径对慢性乙型肝炎患者HBV特异性淋巴细胞功能的影响[J].中华微生物和免疫学杂志，2007;27(9):826-830.

7 Trabattoni D，Saresella M，Biasin M et al．B7-H1 is up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease progression[J].Blood，2003;101(7):2514-2520.

8 Tansuphaasawedikui S，Amornkui P N，Tanchanpong C et al．Clinical presentation of hospitalized adultpatients with HIV infection and AIDS in Bangkok，Thailand[J].Acquir Immune Defic Syndr，1999;21(4):326-332.