人乳腺癌疫苗HSP65-HER2联用CpG684的抗肿瘤作用

吴秀丽 颜游游 宋丹丹 付 尧 华 立 王丽颖 王 华

(吉林大学白求恩医学院分子生物学系，长春130021)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其中大约25%～30%的浸润性乳腺癌过量表达人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor2，HER2)，与乳腺癌病人在短时间内的复发和生存期的缩短有关[1，2]。而 HER2在正常组织中低表达，使HER2成为治疗HER2阳性乳腺癌理想的靶点，很多应用HER2全长或HER2表位构建的肿瘤疫苗已经应用到临床前及临床研究[3，4]。本实验室根据热休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)具有交叉提呈抗原作用将外源性抗原通过MHCⅠ类途径特异性地呈递给CD8+T细胞的功能，构建了包含HSP65与多个HER2 CTL表位的融合蛋白(HSP65-HER2)并初步在体外实验中验证了其抗肿瘤活性[5]，但没进一步验证其在体内的抗肿瘤活性。

CpG ODN作为肿瘤疫苗的佐剂可增强肿瘤抗原的免疫原性，诱导出强大的Th1和CTL型免疫反应，增强肿瘤疫苗的抗肿瘤效果[6]。本研究以小鼠HER2阳性黑色瘤为模型，选用本室自行设计的CpG684作为HSP65-HER2的佐剂，验证二者联用在机体内的抗肿瘤效果。

1 材料与方法

1.1 试剂 RPMI1640干粉培养基，新生牛血清，胰蛋白酶均购于Gibco，CpG684由大连宝生物工程有限公司合成。HSP65-HER2蛋白由本科室构建表达后，冻干保存。

1.2 实验动物和细胞株 C57BL/6雌性小鼠，6～8周龄，由吉林大学动物实验中心提供，转染pcDNA3-GFP-HER2质粒的小鼠黑色瘤细胞株(HER2+B16)来自吉林大学分子生物学实验室[7]。

1.3 动物实验 把C57BL/6雌性小鼠，随机分成3组，每组10只，分别为PBS阴性对照组，CpG684对照组，HSP65-HER2联用CpG684免疫组。免疫流程:小鼠左右腹股沟皮下注射100 μl/只，CpG684的用量为 10 μg/只，HSP65-HER2的用量为 1 μg/只，每隔1周注射1次，共3次。在免疫结束后第4天，将制备的HER2+B16肿瘤细胞悬(0.75×105/只)接种到小鼠腹腔，并检测小鼠的生存期。

2 结果

2.1 HSP65-HER2蛋白鉴定 SDS-PAGE电泳鉴定HSP65-HER2蛋白样品(见图1)。

图1 HSP65-HER2的SDS-PAGE分析Fig．1 Analysis of HSP65-HER2 by SDS-PAGE

图2 小鼠生存期Fig．2 Survival of mice

2.2 小鼠的生存期 生存期结果表明免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠生存期明显延长，接种肿瘤70天后仍有80%的小鼠存活，而CpG684对照组仅有10%小鼠存活(P＜0.01)，PBS对照组无小鼠存活(P＜0.01)。见图2。

3 讨论

由于肿瘤抗原是弱抗原，而热休克蛋白具有交叉提呈外源性抗原通过MHCⅠ类途径提呈给CD8分子，并具有一定非特异性刺激作用，很多实验室将热休克蛋白和肿瘤抗原融合制备肿瘤疫苗[8]。大量实验研究表明热休克蛋白和肿瘤抗原融合蛋白疫苗在动物实验中都取得了良好的抗肿瘤效果，但是在临床实验中的治疗效果不够理想，至今还没有一种热休克蛋白相关性的肿瘤疫苗被批准应用于临床实践[9]。这可能是由于热休克蛋白的免疫刺激作用还不足以打破肿瘤导致的免疫耐受。为了使HSP65-HER2发挥更好的抗肿瘤效果，我们联用了CpG684作为疫苗佐剂。CpG684是我们实验室自行设计的CpG ODN，其作为狂犬疫苗佐剂时显著提高了抗体的产生并使诱导更强的Th1反应，而Th1类反应可以发挥更好的抗肿瘤效果[10]。

实验结果表明免疫了HSP65-HER2和CpG684激发的免疫应答对于HER2+B16肿瘤的攻击起到有效的保护作用，荷瘤小鼠的生存期显著延长(P＜0.01)。这种保护性的免疫应答可能是以细胞免疫应答为主，这是由于该实验小鼠肿瘤模型中所用的HER2+B16细胞表达的HER2蛋白没有跨膜区，细胞表面缺乏HER2的靶点。此外HSP65-HER2多选用HER2的CTL表位，所以该疫苗激发的免疫反应主要是CTL为主。该研究表明HSP65-HER2联用CpG684发挥了明显的抗肿瘤效果，为进一步研究治疗HER2阳性乳腺癌的策略提供新的研究思路。

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6 Weeratna R D，Davis H L，Liana Medynski et al．Potential use of CpG ODN for cancer immunotherapy [J].Update on Cancer Therapeutics，2006;1(1):49-58.

7 李 贺，向泽敏，吴秀丽et al．体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立[J].细胞与分子免疫学杂志，2009;25(1):13-15.

8 Wang H H，Mao C Y，Teng L S et al．Recent advances in heat shock protein-based cancer vaccines[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2006;5(1):22-27.

9 De Gruijl T D，van den Eertwegh A J，Pinedo H M et al．Whole-cell cancer vaccination:from autologous to allogeneic tumorand dendritic cell-based vaccines [J].Cancer Immunol Immunother，2008;57(10):1569-1577.

10 Wang X，Bao M，Wan M et al．A CpG oligodeoxynucleotide acts as a potent adjuvant for inactivated rabies virus vaccine[J].Vaccine，2008;26(15):1893-1901.