香菇多糖和黄芪多糖对免疫抑制小鼠免疫功能调节的研究①

颜 爱 李 波 李润成 喻 凯 余兴龙 (湖南农业大学动物医学院，长沙410128)

多糖是指由10个以上单糖分子链接成的碳水化合物。天然活性多糖是一种良好的免疫增强剂，能够显著提高机体的特异性或非特异性免疫。香菇多糖分离于香菇子实体，黄芪多糖由黄芪根部提取，两者都具有很好的免疫调节作用，在抗病毒、抗肿瘤等方面有广泛的应用[1-3]，它们原料丰富，价格便宜，本研究选用两种多糖腹腔注射免疫抑制模型小鼠，通过检测小白鼠多项免疫指标来评价两种多糖的免疫活性，为临床上更好的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级昆明种雌性小鼠，18～22克，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

1.1.2 主要试剂 香菇多糖(纯度＞45%，陕西方晟生物科技有限公司，BZ-021)，黄芪多糖(纯度＞90%，陕西方晟生物科技有限公司，BZ-017)，依据文献[4]提供方法去除多糖中的蛋白，用蒸馏水配制成浓度为10 mg/ml备用;环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，10051521);小鼠淋巴瘤细胞(Yac-1细胞，上海中科院细胞库，TCM28);MTT(Sigma公司，88417)，细菌脂多糖(LPS，Sigma 公司，L2630);伴刀豆素球蛋白(ConA，Sigma公司，C2010);IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ检测试剂盒(R＆D公司，批号分别为 VAL602、VAL603、VAL605、VAL607)。

1.2 方法

1.2.1 迟发型变态反应及脏器指数

1.2.1.1 动物分组及处理 80只小鼠随机平均分成8组，香菇多糖和黄芪多糖分别设高、中、低剂量组，依次为 20、13、7 mg/kg[5]，另设正常对照组(简称对照组)和免疫抑制模型对照组(简称模型组)。除对照组用等体积生理盐水处理外，其余各组按40 mg/kg环磷酰胺制备免疫抑制模型，每天腹腔注射1次，连续3天。第4天除模型组外分别腹腔注射多糖溶液(0.5 ml/只)，均连续5天，模型组等体积注射生理盐水。

1.2.1.2 迟发型变态反应(DTH) 小鼠连续腹腔注射香菇和黄芪多糖5天后，以0.2%的绵羊红细胞悬液致敏所有小鼠，致敏后第4天用游标卡尺测量小鼠右后足跖部的厚度，测量三次取均值，然后局部注射20 μl的20%绵羊红细胞，24小时后同一部位测定足跖厚度，以两次平均厚度差表示DTH的程度。

1.2.1.3 脏器指数 DTH试验完成后，断颈法处死小鼠，称量体重，解剖摘取免疫器官脾脏和胸腺，去除筋膜和脂肪组织后称重，根据公式计算脾指数和胸腺指数。免疫器官指数=免疫器官重(mg)/体重(g)。

1.2.2 淋巴细胞和细胞因子

1.2.2.1 动物分组及处理 40只小鼠随机分成4组，10只/组，分别是对照组、模型组、香菇多糖组和黄芪多糖组，各组处理同前，多糖剂量根据上述结果选用13 mg/kg，给予多糖后4天，眼球摘除取血法收集血液，分离血清冻存备用，然后断颈处死小鼠制备脾细胞悬液(细胞浓度为2×107个/ml)。靶细胞为复苏传代后收集的对数期Yac-1细胞(细胞浓度为4×105个/ml)。

1.2.2.2 NK细胞活性 96孔细胞培养板的样本测定孔加入已制备好的脾细胞和靶细胞悬液100 μl，效靶比50∶1，靶细胞自然释放孔加入靶细胞和培养液各100 μl，靶细胞最大释放孔加入靶细胞和2.5%Triton各100 μl，上述各项均设3个复孔，处理好后于37℃，5%CO2培养箱中培养4小时，将培养物分别转入灭菌离心管，1 500 r/min离心5分钟，取上清100 μl置96孔培养板，同时加入乳酸脱氢酶(LDH)基质液100 μl，反应3分钟后每孔加入1 mol/L HCl 30 μl，于酶标仪490 nm处测定光密度值(OD)，计算 NK细胞活性。NK细胞活性(%)=

1.2.2.3 淋巴细胞增殖试验 调整脾细胞浓度至2 ×106个/ml，加入 96 孔细胞培养板中，100 μl/孔，参照文献[6]操作。

1.2.2.4 IL-2、IL-4、IL-10和 IFN-γ 含量 按照R＆D公司的ELISA试剂盒检测说明书检测血清中IL-2、IL-4、IL-10 和 IFN-γ 的浓度。

1.3 统计学方法 本实验中数据资料均应用Excel进行处理，采用t检验方法进行统计学分析，实验结果用±s表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 对DTH的影响 香菇多糖和黄芪多糖对免疫抑制小鼠DTH影响结果见表1。环磷酰胺能显著抑制正常小鼠的迟发型变态反应(P＜0.05)。两种多糖各剂量均能有效消除环磷酰胺的抑制作用(P＜0.05)，并呈量效关系。比较多糖组与对照组，香菇多糖各剂量组与对照组差异无统计学意义，而黄芪多糖的中、高剂量组小鼠DTH不仅恢复，甚至显著高于对照组(P＜0.05)。黄芪多糖在剂量为20 mg/kg时的作用尤为明显(P＜0.01)，两种多糖之间的差异不显著。

表1 不同剂量的两种多糖对小鼠迟发型变态反应程度的影响Tab．1 The effect of various doses of polysaccharides on DTH in mice

表2 黄芪多糖和香菇多糖对小鼠脾及胸腺指数的影响Tab．2 The influence of astragalus and lentinan on the spleen and thymus index of mice

表3 香菇及黄芪多糖对NK细胞活性的影响Tab．3 The influence of astragalus and lentinan on the activity of NK cell

表4 小鼠脾淋巴细胞转化结果(OD值)Tab．4 The mice spleen lymphocyte proliferation(OD value)

表5 IL-2、IL-4、IL-10 及 IFN-γ的浓度(pg/ml)Tab．5 The concentration of IL-2，IL-4，IL-10 and IFN-γ(pg/ml)

2.2 对脾指数和胸腺指数的影响 结果见表2。与对照组相比，模型组小鼠胸腺指数显著降低(P＜0.05)，脾指数显著升高(P＜0.05)。在脾指数方面，两种多糖各剂量组都能使其极显著增高(P＜0.01)。就胸腺指数而言，多糖组与模型组之间差异无统计学意义，香菇多糖组胸腺指数有随剂量的增大而升高的趋势，黄芪多糖组却呈相反趋势。两种多糖各个剂量组之间差异不显著。

2.3 对NK细胞活性的影响 以乳酸脱氢酶释放法测定小鼠NK细胞活性(结果见表3)，环磷酰胺能显著抑制小鼠NK细胞活性(P＜0.05)。香菇多糖和黄芪多糖不仅能恢复抑制小鼠的NK细胞活性(P＜0.01)，而且都明显高于对照组。两种多糖比较，香菇多糖对NK细胞活性的恢复作用优于黄芪多糖，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。

2.4 对脾淋巴细胞增殖能力的影响 MTT法测定小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(表4)，结果显示，模型组和对照组间差异不显著;当用LPS刺激脾淋巴细胞时，两种多糖都能显著提高小鼠B淋巴细胞的转化能力(P＜0.05);当使用ConA刺激时，香菇多糖和黄芪多糖均极显著提升T淋巴细胞的转化能力(P＜0.01);两种多糖影响T细胞增殖的差异不显著，但在B细胞转化方面香菇多糖极显著高于黄芪多糖(P＜0.01)。

2.5 对细胞因子水平的影响 用ELISA方法检测血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的浓度水平，结果见表5。环磷酰胺对于所测血清细胞因子水平均有明显的抑制效果(P＜0.05)，两种多糖皆能拮抗环磷酰胺的抑制作用，香菇多糖对四个因子水平的促进作用极显著(P＜0.01)，但只有IFN-γ水平恢复至正常，黄芪多糖仅显著提高IL-4和IL-10水平，对IL-2和IFN-γ仅有恢复趋势。此外，香菇多糖对IL-2、IFN-γ和IL-4三种因子的促进作用要显著高于黄芪多糖(P＜0.05)，而对于IL-10两者差异不显著。

3 讨论

脾脏和胸腺是机体重要的免疫脏器，脾指数和胸腺指数在一定程度上可以反映机体免疫功能。环磷酰胺能升高脾脏指数可能是环磷酰胺停用后，脾脏会迅速恢复并出现“反跳”现象[7，8];而降低胸腺指数，则可能是胸腺淋巴细胞较脾淋巴细胞更易于凋亡，不仅如此，胸腺淋巴细胞的凋亡可直接或间接地促进脾淋巴细胞的增殖[9]，而且在应激或免疫抑制剂的作用下，胸腺比脾脏更易于萎缩[10]。有研究发现香菇和黄芪两种多糖有拮抗抑制剂降低小鼠脏器指数的作用，本研究中与其存在差异，从随黄芪多糖剂量的增加胸腺指数降低的趋势看，不排除是对胸腺的毒副作用，事实上有研究表明延长黄芪多糖的给药时间可对胸腺产生轻度的抑制作用[11]。

致有丝分裂原ConA和LPS可分别使小鼠T、B淋巴细胞分裂增殖，常用于衡量淋巴细胞免疫应答的功能。在本研究中，两种多糖的应用可促进淋巴细胞的增殖，说明它们能恢复环磷酰胺对淋巴细胞增殖的抑制作用。

NK细胞即参与适应性免疫应答，也是固有免疫重要的效应细胞。NK细胞通过分泌IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等细胞因子发挥免疫调节作用，其自身的杀瘤功能也可被IFN-α、IFN-γ和IL-2等细胞因子所强化。多糖能消除环磷酰胺对NK细胞活性的抑制作用，表明香菇多糖和黄芪多糖在提高NK细胞活性方面有积极作用。

Th1和Th2细胞是两种重要的淋巴细胞亚群，它们比例的相对恒定对维持免疫功能的稳定至关重要，检测 IL-2、IFN-γ 和 IL-4、IL-10可以分别反映Th1和Th2细胞的功能，而且这些细胞因子也具有广泛的生物学活性。本研究中，Th1和Th2型细胞因子均受到环磷酰胺的显著抑制，香菇多糖对Th1和Th2型细胞因子水平都显著提高，有利于抑制小鼠免疫功能的恢复，而黄芪多糖则对Th2的促进作用更为明显，可能是来源的不同的多糖对免疫的影响不同。

本文通过检测免疫抑制小鼠多项免疫指标评估香菇和黄芪多糖对小鼠免疫功能的调节作用，表明香菇和黄芪多糖在剂量为13 mg/kg时可以较理想地恢复免疫抑制小鼠的免疫能力，且香菇多糖的效果优于黄芪多糖。

1 Wong K H，Lai C K M，Cheung P C K.Immunomodulatory activities of mushroom sclerotial polysaccharides [J].Food Hydrocolloid，2011;25(2):150-158.

2 Li R，Chen W C，Wang W P et al．Extraction，characterization of Astragalus polysaccharides and its immune modulating activities in rats with gastric cancer[J].Carbohyd Polym，2009;78(4):738-742.

3 Wang J X，Tong X，Li P B et al．Immuno-enhancement effects of Shenqi Fuzheng injection on cyclophosphamide-induced immunosuppression in Balb/c mice [J].J Ethnopharmacol，2012;139(3):788-795.

4 扈瑞平，张兴夫，杜 玲et al.沙葱多糖Sevage法除蛋白工艺的研究[J].内蒙古大学学报(自然科学版)，2009;40(6):658-662.

5 Zhang N W，Li J F，Hu Y X et al．Effects of astragalus polysaccharide on the immune response to foot-and-mouth disease vaccine in mice[J].Carbohyd Polym，2010;82(3):680-686.

6 卢殿荣，祝彼得，卢殿香et al.香菇多糖对正常小鼠以及免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].甘肃中医学院学报，2004;21(4):20-23.

7 Willers J M，Sluis E.The influence of cyclophosphamide on antibody formation in the mouse[J].Ann Immunol(Inst Pasteur)，1975;126(3):267-279.

8 王彩英，邢善田.环磷酰胺对小鼠B、T淋巴细胞及巨噬细胞活力的影响[J].军事医学科学院院刊，1982;6(3):367-372.

9 陈海英，陈建明，郑建盛.胸腺细胞渐进性凋亡对大鼠脾脏淋巴细胞增殖功能的影响[J].长治医学院学报，2009;23(2):95-98.

10 孙 荭，程云华，何贤辉et al.应激及地塞米松对小鼠胸腺细胞和脾脏细胞凋亡的作用[J].暨南大学学报(自然科学版)，2001;22(3):120-121.

11 许嘉弟，宋继志，沈美玲et al.黄芪多糖对小鼠胸腺和脾免疫活性细胞的影响[J].南京铁道医学院学报，1983;2(1):32-35.