Graves病患者131I治疗前后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的变化①

查兵兵 刘 军 查 英 王 芳 盛 励 丁和远 陈灶萍 徐 炯

(复旦大学上海医学院上海市第五人民医院内分泌科，上海200240)

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞是一类具有免疫抑制功能的细胞群，它在维持外周免疫耐受、预防自身免疫性疾病中发挥着重要作用［1-3］。转录因子Foxp3是调节性T细胞的特异性标志［4，5］。近几年来，一些国内外学者开始致力于研究 CD4+CD25+T细胞在Graves病中所发挥的作用。Saitoh［6］通过试验发现在给CD4+CD25+T细胞基因敲除C57BL/6小鼠注射重组TSH受体后相对于正常小鼠更容易发生甲状腺机能亢进，这说明CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在Graves病的发生和发展过程中的确起到一定作用，而我们将进一步研究它是否在Graves病的治疗过程中存在作用。在临床实践中，131I是Graves病最常用的治疗方法，它除了能释放β射线破坏甲状腺滤泡上皮减少甲状腺激素的分泌，也可以抑制甲状腺内淋巴细胞产生抗体［7］，这说明131I在Graves病的治疗中存在免疫作用机制。因此，我们将通过检测和比较Graves病患者131I治疗前后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞及其它淋巴细胞亚群的变化，验证调节性T细胞含量的变化是否参与131I治疗Graves病的免疫作用机制，并进一步探讨131I这一治疗方案对Graves病患者免疫应答及免疫耐受两方面的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本课题组自2009年10月至2011年3月在内分泌科病房和门诊入选受试者。调查对象为Graves病患者30例，其中女性19名，男性11名，年龄25～52岁，平均年龄32岁，Graves病患者为通过甲状腺指标和B超确诊的初发或复发患者，患者均入院接受131I治疗，患者入组的时候排除Graves病合并眼病、Graves病应用免疫抑制剂、妊娠可能的育龄妇女以及有其它自身免疫性疾病、感染或患有各种恶性肿瘤的患者。

1.2 主要试剂和仪器 流式细胞仪(美国BD LSRⅡ);人淋巴细胞分离液(加拿大，Cedarlane Laboratories);Human Treg Flow Kit试剂盒(Foxp3-APC/CD4-FITC/CD25-PE，美国，eBioscince);抗 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3－CD19+及 CD3－CD16+CD56+抗体(美国，BD公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞染色 抽取5 ml静脉血加入肝素抗凝管，用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞。部分单个核细胞通过流式细胞仪检测 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3－CD19+及 CD3－CD16+CD56+细胞数。取100 μl细胞悬液(1×106)加入CD4-FITC/CD25-PE双标抗体20 μl，室温避光染色20分钟后，用染色缓冲液洗涤1次，加入新配制的固定/透膜液1 ml，室温暗处孵育20分钟，离心弃上清，再用染色缓冲液洗涤1次，加1 ml透膜缓冲液室温避光15分钟，离心弃上清，加入100 μl透膜缓冲液重悬细胞，再加入APC标记Foxp3抗体5μl，室温避光孵育30分钟后，洗涤2次，加入0.5 μl染色缓冲液混匀，用流式细胞仪收集20 000个细胞/管，Flowjo软件获取并分析数据，以三色荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。

1.3.2 Real-Time PCR检测外周血单个核细胞的Foxp3mRNA 采用Trizol试剂抽提外周血的mRNA，紫外分光光度计测定 OD260/OD280在1.8～2.0 之间，总 RNA 2 μg，逆转录为 cDNA，再进行荧光定量 PCR扩增。每一标本取cDNA模板2 μl，Foxp3上下游引物各10 pmol，TaqMan探针5 pmol，GoldTaqDNA聚合酶2.5 μ，最后反应总体积为25 μl。在 GeneAmp 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems，USA)软件分析下得到CT值，经内参照GAPDH校正，校正值2－△△CT进行统计分析。Foxp3引物:forward:5'-CACCTGGCTGGGAAAATGG-3';reverse:5'-GGAGCCCTTGTCGGATGAT-3'，TaqMan 探针:5'-FAM-ACTGACCAAGGCTTCAT-3'。

1.3.3 化学发光免疫分析法检测甲状腺功能 游离三碘甲状腺原氨酸(fT3)(正常值:2.3～4.2 pg/ml)、游离甲状腺素(fT4)(正常值:0.89 ～1.76 ng/dl)、促甲状腺素(TSH)(正常值:0.35 ～5.5 μU/ml)、抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)(正常值:0～60 U/ml)及抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)(正常值:0～60 U/ml)(美国，Siemens Medical Solutions Diagnostics)。

2 结果

2.1 Graves病患者131I治疗前后甲状腺激素水平Graves病患者经过131I治疗前后的甲状腺激素水平和TPOAb、TgAb检测结果见表1。与治疗前比较，Graves病患者经过131I治疗后血清fT3和fT4明显下降，TSH 水平明显升高(P ＜0.01)，但 TPOAb、TgAb水平并没有明显改变。

2.2 Graves病患者131I治疗前后外周血淋巴细胞亚群的比例 表2所示，和治疗前相比，131I治疗后1个月Graves病患者外周血CD3+CD4+T和CD3－CD19+B细胞百分率都明显减少(P ＜0.05)，CD3－CD16+CD56+NK细胞百分率明显增加(P＜0.05)，CD3－CD8+T细胞有增加趋势，但是没有统计学差异。各组 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3－CD19+、CD3－CD16+CD56+淋巴细胞亚群的百分率与fT3、fT4、TSH、TGAb及 TPOAb均未显示明显相关性。

2.3 Graves病患者131I治疗前后外周血 CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分率131I治疗前及治疗后1个月Graves病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞占淋巴细胞的比例分别为(1.12±0.60)%和(1.22±0.77)%(图1)，经过131I治疗后Graves病患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞有增加趋势，但差别无临床统计学意义。各组CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分率与 fT3、fT4、TSH、TGAb及TPOAb均未显示相关性。

表1 Graves病患者131I治疗前后甲状腺功能的变化Tab.1 The thyroid function of Graves'disease before 131I administration and in the first month after 131I administration

表2 Graves病患者131I治疗前后外周血淋巴细胞亚群的比例Tab.2 The proportion of peripheral blood lymphocyte subsets in Graves'disease before 131I administration and in the first month after 131I administration

图1 Graves病患者131I治疗前后外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞亚群比例的散点图Fig.1 The parameter scatter diagram of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells from peripheral blood of Graves'disease patients before 131I administration and in the first month after 131I administration

图2 Graves病患者131I治疗前后外周血中Foxp3mRNA的表达Fig.2 Foxp3mRNA expression from peripheral blood of Graves'disease patients before 131I administration and in the first month after 131I administration

2.4 Graves病患者131I治疗前后外周血中Foxp3mRNA的表达 我们在对外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞占淋巴细胞的比例的检测基础上，应用Real-Time PCR对CD4+CD25+Foxp3+T细胞特异性标志Foxp3基因进行了检测，结果显示131I治疗前及治疗后1个月Graves病患者外周血Foxp3mRNA的表达有增加趋势，但差别无临床统计学意义(P＞0.05，图2)。

3 讨论

Graves病属于自身免疫性甲状腺疾病，AITD患者甲状腺细胞表面HLA分子以及其他免疫相关性抗原的异常表达使其成为抗原递呈细胞，在树突状细胞和B细胞的协同作用下，激发和加重T细胞介导的免疫反应，造成T淋巴细胞增殖及B淋巴细胞产生促甲状腺素受体抗体(TRAb)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)。目前Graves病的治疗方案包括131I治疗、口服抗甲状腺药物和手术治疗，由于131I治疗比较方便快捷，仍是Graves病患者中无131I治疗禁忌症患者的首选治疗方案。

为了研究131I对Graves病的免疫状态的影响，刘世娟等［8］动态检测并分析了131I治疗前及治疗后1、3、6、9、12 个月 Graves病患者免疫学相关指标的变化，结果发现Graves病患者经过131I治疗后CD4+T细胞有减少趋势，而CD8+T细胞有增加趋势，考虑到患者经过131I治疗后会有不同转归，部分患者需要及时加用其他口服药物，为了排除口服药物可能会影响调节性T细胞含量的干扰，我们的试验仅检测了治疗后1个月患者的各项免疫指标。我们的研究发现Graves病患者131I治疗1个月后外周血CD3+CD4+T细胞和CD3－CD19+B细胞百分率都明显减少，因为CD19与B细胞活化和信号的转导有关，而CD4+T细胞能选择高亲和力B细胞分化为记忆细胞或浆细胞参与体液免疫应答。因此，外周血CD3+CD4+T细胞和CD3－CD19+B细胞含量的减少可以减少患者体内过度的免疫应答。另外，131I治疗后Graves病患者的CD3－CDl6+CD56+NK细胞含量有所增加，NK细胞含量的增加使甲状腺细胞内浆细胞分泌的大量自身抗体可以被NK细胞及时的清理，从而也控制甲状腺组织过度的免疫应答。

由于人们对自身淋巴细胞亚群的深入认识和进一步分类，目前认为Graves病患者由于先天性免疫监视缺陷，机体存在免疫耐受障碍，抑制性免疫细胞功能的减弱导致了T细胞和B细胞功能的增强。调节性T细胞是目前研究最多的具有免疫抑制功能的T细胞，是已知的抑制功能最强、抑制谱最广的一群免疫细胞，能抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、树突状细胞、肥大细胞等多种免疫细胞［9］，钱伟等［10］通过流式细胞术测定了 Graves 病患者经过口服抗甲状腺药物治疗前后外周血淋巴细胞Foxp3的表达，结果发现Graves病患者治疗前后外周血中 CD4+CD25+T细胞数量并无减少，但Foxp3+表达均显著降低，而我们研究了Graves病患者经过131I治疗前及治疗后1个月外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞及Foxp3mRNA的表达水平，发现经过131I治疗后Graves病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例及Foxp3mRNA的表达水平有增加趋势，但无临床统计学意义。因此，我们推测131I虽然可以通过减少CD4+T和B淋巴细胞的增殖失控和增加NK细胞的含量来控制过度的免疫应答，但是不能通过增加调节性T细胞的含量从而改善Graves病患者的免疫耐受障碍。

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4 Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 ［J］.Science，2003;299(5609):1057-1061.

5 Banham A H，Powrie F M，Suri-Payer E.FOXP3+regulatory T cells:current controversies and future perspectives［J］.Eur J Immunol，2006;36(11):2832-2836.

6 Saitoh O，Nagayama Y.Regulation of Graves'hyperthyroidism with naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells in a mouse model［J］.Endocrinology，2006;147(5):2417-2422.

7 王吉耀，廖二元，胡品津.内科学［M］.北京:人民卫生出版社，2002:887-887.

8 刘世娟，王洪刚，冯永堂et al.131I治疗Graves病免疫状态变化的规律及临床价值［J］.潍坊医学院学报，2005;27(6):410-413.

9 Nagler-Anderson C，Bhan A K，Podolsky D K et al.Control freaks:immune regulatory cells［J］.Nat Immunol，2004;5(2):119-122.

10 钱 伟，张 强，吴汉妮.Foxp3在Graves病患者外周血单个核细胞中的表达及临床意义［J］.中国免疫学杂志，2011;27(1):76-78.