NF-κB在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨①

夏龙飞 周 红 胡丽超 陈东东 解鸿翔 王 婷 穆 原

(江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江212013)

抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)是一种以体内持续存在抗磷脂抗体(Antiphospholipid antibody，aPL)、临床以动静脉血栓形成、习惯性流产等为主要特征的自身免疫性疾病［1］。本组前期研究及相关文献显示，β2糖蛋白Ⅰ (beta-2-glycoproteinⅠ，β2GPⅠ)与其相应抗体(anti-β2GPⅠ)复合物(anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ)能够刺激单核细胞、内皮细胞等表达组织因子(Tissue factor，TF)，从而导致血液高凝状态［2］。进一步研究发现细胞表面受体AnnexinA2(ANX2)及Toll样受体4(Tolllike receptor 4，TLR4)作为β2GPⅠ的共受体，能够介导抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的激活［3-5］。众所周知，TLR4被其配体激活后，将招募并激活细胞内一系列信号蛋白，如丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，最终导致相关基因的转录，从而引起相关效应［6，7］。核因子 κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一种广泛存在的核转录因子，可参与对多种基因的转录来调控相关效应。近年来有研究显示NF-κB在TLR4相关的信号通路中发挥重要作用。本文主要探讨NF-κB在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物刺激THP-1细胞诱导TF表达过程中是否被激活及其作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 人单核细胞株THP-1(上海中国科学院细胞研究所)，RPMI1640(Gibco公司)，超级新生牛血清(Gibco公司)，兔抗人NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65单克隆抗体及兔抗人NF-κB抑制蛋白IκB-α多克隆抗体(Cell signaling公司)，鼠抗人β-actin抗体(Protein tech Group公司)，非特异性同型对照抗体R-IgG(武汉博士德生物工程有限公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(Toyobo公司)，TF活性试剂盒(Assaypro公司)，定量PCR试剂盒(杭州博日科技有限公司)，ECL显色试剂(GE Healthcare 公司)，LPS(Sigma 公司)，NF-κB抑制剂PDTC、p38抑制剂SB203580(Sigma公司)，ERK1/2抑制剂U0126(Promega公司)，JNK抑制剂SP600125(R＆D公司)，多克隆抗β2GPⅠ抗体和β2GPⅠ(本实验室制备)，引物(设计采用primer 5.0，由上海生物工程有限公司合成)，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 THP-1细胞培养 采用 RPMI1640培养液(含10%新生牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素)培养THP-1细胞，置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱培养，待细胞长满培养瓶底部70% ～80%时，细胞传代，取传代3～10次的细胞用于实验。

1.2.2 细胞总RNA的提取和逆转录 将状态良好的THP-1细胞种入6孔板内(2×106/孔)，37℃、5%CO2培养24小时后，弃去培养液，换1 ml无血清RPMI1640继续培养12小时。根据需要将细胞与NF-κB抑制剂PDTC(20 μmol/L)预先孵育90分钟，然后根据实验设计加入不同刺激物处理细胞2小时，收集细胞，加入1 ml Trizol裂解，混匀后于室温放置20分钟充分裂解，按Trizol说明书提取细胞总RNA。逆转录体系按照试剂盒说明操作，反应条件:37℃ 30分钟，98℃ 5分钟，4℃ 5分钟。反应所得cDNA用于检测mRNA表达。

1.2.3 细胞裂解物的制备 收集传代3～10次、状态良好的THP-1细胞，种于6孔板内，密度为2×106/孔，37℃、5%CO2培养箱培养24小时后，弃去上清，加入无血清RPMI1640培养液饥饿12小时后，弃上清，再加1 ml无血清RPMI1640培养基，然后用不同刺激物处理细胞。抑制试验时将不同抑制剂(SB203580，10 μmol/L;SP600125，5 μmol/L;U0126，90 nmol/L)与细胞预处理30分钟再加刺激物。收集细胞，加入适量细胞裂解液，于冰上裂解1小时，期间每隔15分钟剧烈震荡一次，4℃ 11 200 r/min离心10分钟后取上清，测定蛋白浓度，－70℃保存备用。

1.2.4 实时定量 PCR(Real time quantitative PCR，RT-qPCR)检测 定量PCR分析仪检测细胞TF mRNA水平，总反应体系为12 μl:其中2×SYBR Mix 6 μl，上下游引物各0.48 μl，最后用灭菌 ddH2O补足至12 μl。TF引物序列为:上游5'-TCAGGTGATCCACCCACCTT-3'，下 游 5'-GCACCCAATTTCCTTCCATTT-3'，扩增产物为211 bp;β-actin引物序列为:上游 5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，下游5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'，扩增产物为262 bp。RT-qPCR循环参数为:95℃预变性5分钟;一个循环:95℃ 15 秒，62℃(β-actin、TF)20 秒，72℃20秒;38个循环扩增。目的基因的相对表达水平=目的基因拷贝数/β-actin拷贝数。

1.2.5 Western blot分析 取上述收集的细胞裂解物标本(总蛋白60 μg)与样本缓冲液作用，94℃变性5分钟后，12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，再以350 mA恒流转印至PVDF膜;膜置于5%脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1小时;再分别用相应的兔抗人NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、IκB-α抗体或鼠抗人β-actin抗体(1∶2 500)4℃孵育过夜;次日用TBS/T洗涤3次，15分钟/次，采用HRP标记的羊抗兔 IgG(1∶2 000)或羊抗鼠 IgG(1∶3 000)，37℃孵育 1小时，TBS/T洗涤 3次，15分钟/次，ECL显色系统定影显色，观察杂交条带，同时运用Champchemi分子成像系统扫描条带并读取灰度值。

1.2.6 TF活性检测 利用TF/Ⅶa复合物使因子Ⅹ转变为活化因子Ⅹa，根据Ⅹa生成量来判定细胞TF的活性。测定标本为细胞裂解物，严格按照试剂盒说明书操作。在96孔反应板中加入50 μl的样品稀释液和10 μl的因子Ⅶ后，分别加入倍比稀释的标准品和测定样本10 μl，以样品稀释液为空白，37℃反应30分钟后，加入因子Ⅹ。37℃反应30分钟后再加入Ⅹa的发色底物，于405 nm、37℃ 条件下测定吸光度值。吸光度值与样品中TF活性呈正相关，TF活性结果以pmol/L(pmol/L)表示。

1.3 统计学分析 采用软件SPSS10.0进行统计学分析，所有数据以±s表示。对单因素处理组之间数据的比较采用One-way ANOVA方法，对双因素处理组之间数据的比较采用Two-way ANOVA方法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性 前期研究发现抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物能够诱导血液单核细胞及单核细胞株THP-1细胞表达 TF。本实验以 R-IgG/β2GPⅠ(同型抗体对照，100 μg/ml)、抗 β2GPⅠ/BSA(同型抗原对照，100 μg/ml)、LPS(阳性对照，500 ng/ml)及抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100 μg/ml)分别刺激THP-1细胞2、6小时后，分别收集细胞提取总RNA和细胞裂解物，进行了RT-qPCR及TF活性试剂盒分析。如图1显示，抗β2GPⅠ/β2GPⅠ 复合物使TF mRNA表达水平显著增加及TF活性明显增强，与LPS具有相同的刺激效应，与空白对照组(media)比较，差异显著(P＜0.05)，而同型抗体对照R-IgG/β2GPⅠ和抗原对照抗β2GPⅠ/BSA则无此作用。

2.2 抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物促进 THP-1细胞NF-κB的活化 为了观察 NF-κB是否在 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激THP-1细胞过程中被激活，我们收集刺激不同时间点的细胞总蛋白，利用相应抗体进行Western blot分析。由图2可见，THP-1细胞经anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物刺激后，NF-κB 总蛋白(t-NF-κB p65)水平变化不明显，但是NF-κB 的磷酸化(p-NF-κB p65)在逐渐增强，并在90分钟时达到高峰而后降低;另外，与NF-κB的磷酸化相反，IκB-α蛋白水平随复合物作用逐渐下降，于90分钟达到最低水平，之后逐渐恢复。说明抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物作用于细胞，促进了 IκB-α 与 NF-κB(p65/Rel A)解离，后者被激活从而发挥转录活性。

2.3 不同刺激物对THP-1细胞NF-κB p65磷酸化及IκB-α 蛋白的影响 上述结果表明，anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ能够促进THP-1细胞内NF-κB磷酸化并具有时效性，本实验进一步验证这一效应的特异性。我们采用了不同组合刺激物处理THP-1细胞90分钟，收集细胞提取蛋白标本，进行Western blot分析，比较各组的刺激效应。结果显示，同源对照抗体与β2GP Ⅰ组合(R-IgG/β2GP Ⅰ，100 μg/ml)以及无关抗原对照抗牛血清白蛋白与β2GPⅠ(anti-β2GPⅠ/BSA，100 μg/ml)均不能引起 NF-κB p65的磷酸化以及IκB-α 降解;而抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ (100 μg/ml)能够明显增加磷酸化NF-κB p65的表达(图3)，与空白对照(media)比较，条带明显增强，同时降低IκB-α蛋白含量，条带弱于对照;LPS(500 ng/ml)作为阳性对照，具有增强 NF-κB p65磷酸化并降低 IκB-α含量的效应。表明anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物刺激THP-1细胞NF-κB p65磷酸化的刺激效应具有特异性，结果与LPS相似。

图1 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导的 THP-1细胞 TF mRNA(A)表达及TF活性(B)Fig.1 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ complex induces TF mRNA expression(A)and TF activity(B)in THP-1 cells

图2 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激 THP-1 细胞 NF-κB p65的磷酸化及IκB-α变化的时效性Fig.2 Time course of anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced NF-κB p65 phosphorylation and IκB-α change in THP-1 cells

图3 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激 THP-1 细胞 NF-κB p65磷酸化及IκB-α变化的特异性Fig.3 Specific effects of anti-β2GPⅠ/β2GPⅠon NF-κB p65 phosphorylation and IκB-α change in THP-1 cells

2.4 NF-κB 抑制剂 PDTC 对 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞TF表达的干预效应 本实验进一步明确了NF-κB抑制剂PDTC是否影响anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞TF表达的作用。结果显示:PDTC(20 μmol/L)能够明显降低 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激细胞表达TF mRNA(图4A)和TF活性(图4B)，与PDTC未处理组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而PDTC对无刺激的THP-1细胞没有明显影响(P＞0.05)。本实验进一步表明NF-κB 在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导 THP-1 细胞表达TF的过程中具有重要的作用。另外，NF-κB抑制剂PDTC也能够抑制LPS对细胞TF表达的刺激效应。

2.5 上游信号分子MAPKs的抑制剂对抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞NF-κB磷酸化的影响 为明确在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中NF-κB的磷酸化与信号通路中上游关键分子 MAPKs之间的关系，我们采用了MAPKs抑制剂进行试验。结果显示:p38抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂 U0126及 JNK抑制剂SP600125分别单独作用细胞，可使抗β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激细胞NF-κB磷酸化水平有所降低，与无抑制剂处理组比较，p-NF-κB p65条带减弱(图5)，对LPS刺激细胞NF-κB磷酸化似乎无明显影响;若同时使用二种抑制剂(SB203580/U0126，U0126/SP600125，SB203580/SP600125)，均可使抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ及LPS引起的NF-κB磷酸化水平明显降低，条带显著减弱(图5)。三种抑制剂对未刺激的THP-1细胞基础NF-κB磷酸化水平无抑制作用(见media组)。

图4 NF-κB特异性抑制剂PDTC干预anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导的THP-1细胞TF mRNA表达(A)及TF活性(B)Fig.4 The effects of NF-κB inhibitor PDTC on anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced TF mRNA expression(A)and TF activity(B)in THP-1 cells

图5 MAPKs抑制剂对anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ处理THP-1细胞对NF-κB活化的影响Fig.5 The effects of MAPKs inhibitors on anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced NF-κB activation in THP-1 cells

3 讨论

核因子κB(NF-κB)是从B淋巴细胞核抽提物中检测到的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异结合的核蛋白因子，是一类普遍存在的转录因子。哺乳动物NF-κB家族包括NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、RelB 和 c-Rel五个成员，除了Rel-B只能与P50或者P52有效的结合外，存在所有的同源或异源二聚体组合的可能性，并且都具有NF-κB的活性，最常见的二聚体形式是p65/p50异源二聚体。静息状态下NF-κB二聚体与IκB结合，以无活性形式存在于胞浆。而当TNF-α、TLR激动剂等刺激信号作用细胞时，促使IκB-α磷酸化，然后被泛素结合酶识别发生快速泛素化继而被蛋白酶体蛋白水解。随着IκB-α的降解，NF-κB二聚体被释放，进而迅速转入核内，与相应的κB位点结合，从而对相关基因表达进行调控［8］。NF-κB体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递［9］。

本研究小组前期对抗磷脂综合征(APS)血栓形成机制的探讨，证明了抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物刺激血液单核细胞表达TF是其主要机制之一。并发现抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物能够产生与LPS相同的刺激效应，显著增加单核细胞株 THP-1表达TLR4、MD-2及MyD88 mRNA及蛋白水平的表达，并且部分依赖ANX2，随后招募一系列蛋白(包括IRAK1/4、TRAF6及MAPKs)发生级联反应，最终促进细胞表达TF，从而参与APS血栓形成［10］。本文进一步发现NF-κB在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中被诱导活化，提示NF-κB在其中扮演着重要作用。近年来有文献报道NF-κB参与了抗磷脂抗体(aPL)诱导内皮细胞及单核细胞活化［11，12］，但是关于 NF-κB 参与抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF鲜有报道。本研究采用不同对照刺激物处理细胞后，发现抗β2GPⅠ/β2GPⅠ对NF-κB的活化具有特异性。

为进一步证明 NF-κB在抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞表达TF过程中的作用，本研究采用NF-κB特异性抑制剂PDTC以及上游关键信号分子MAPKs特异性抑制剂(p38、ERK及JNK的特异抑制剂SB203580、U0126、SP600125)进行验证。结果显示PDTC能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞TF的表达，并且MAPKs特异性抑制剂能够抑制NF-κB的活化。有文献报道MAPKs的活化对于抗β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激细胞表达相关因子是必需的，结合本文结果，进一步表明在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导 THP-1细胞表达TF的信号转导过程中，MAPKs/NF-κB通路至关重要，提示可作为分子靶点用于防治抗磷脂综合征的血栓形成［7，8］。

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