复发性流产患者妊娠早期滋养细胞中E-cadherin的表达及其与HPV感染的相关性①

郭俊成 车秀英 朱壮彦 刘润花 赵富玺 (山西大同大学免疫学研究所，大同037009)

E-钙粘素(E-cadherin)是介导细胞-细胞间、细胞-基质间粘附作用的细胞因子，在胚泡植入与滋养细胞的迁移与浸润过程中起重要作用[1]。最近发现，HPV16 可以抑制 E-cadherin 基因的转录[2]，还能对体外培养的绒毛癌BeWo细胞的迁移、粘附产生负面影响[3]，而关于人绒毛滋养细胞HPV感染与复发性流产相关性的报道目前相对较少。因此，本研究通过对复发性流产患者妊娠早期绒毛滋养细胞中E-cadherin的表达，以及HPV的感染状况进行检测，以探讨HPV感染与复发性流产的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2007年8月至2010年6月在我市各大医院妇科门诊就诊的早期妊娠的复发性流产患者34例，在排除子宫畸形、宫内(细菌、真菌、原虫等)感染、内分泌及夫妇染色体异常，以及既往无自身免疫性疾病史后作为实验组。患者年龄22 ～41岁(30.4±5.2)岁，孕期38 ～90天，孕次2～5次，流产次数2～4次;选取同期正常早孕行人工流产患者41例为对照组，年龄21～44岁(28.1±6.3)岁，对照组无不孕、自然流产、死胎等不良孕产史。两组患者年龄、孕周、停经天数无显著性差异。

1.2 标本采集 复发性流产患者在确认胚胎停止发育或难免流产行清宫，以及正常早孕者行人工流产时，取其绒毛组织，立即置入10%甲醛溶液中固定24小时，常规石蜡包埋，连续切片。

1.3 试剂和方法

1.3.1 E-cadherin免疫组化检测 兔抗人E-cadherin单克隆抗体及免疫组化检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。实验步骤依照S-P试剂盒说明书进行。胞膜和/或胞浆内呈现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片在高倍镜下随机选取5个视野，阳性细胞数在5%以上记作阳性例数。计数标准为:0～5%(-)，6% ～20%(+)，21% ～50%(++)，51% ～100%(+++)。

1.3.2 HPV-DNA PCR法检测 使用美国ABI 9700 PCR仪进行HPV-DNA检测。实验步骤为①将组织细胞加入配置好的细胞消化液以释放细胞DNA;②选用HPV L基因区的共有引物GP5+/GP6+和β-globin基因引物Glob-F/Glob-R对所有标本进行PCR检测;③再选用改进的共有引物PGMY09/11对所有β-globin阳性而HPV阴性的标本进行再次扩增[4](表1)，这样可检出HPV-6、11、16、18、30、31、33、35、45、51和52。

表1 PGMY，GP5+/6+及Glob-F/R引物序列Tab．1 PGMY，GP5+/6+and Glob-F/R primer sequences

扩增体系包括 DNA 模板15 μl，10×Buffer液10 μl，Taq 酶 5 U，引物各 0.1 mmol/L，四种单核苷酸(dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)各 0.2 mmol/L。扩增过程:94℃预变性5分钟，设定30个循环，每个循环为 94℃20秒，39℃ (GP5+/GP6+)和 55℃(PGMY 09/11;Glob-F/Glob-R)20秒，72℃ 40秒，最后72℃延伸5分钟。所有PCR扩增过程均包含HPV阳性、阴性对照以及β-globin基因对照。

1.4 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件对实验数据进行Wilcoxon秩和检验、χ2检验(包括Fisher确切概率法)，检验水准α=0.05。

2 结果

E-cadherin在实验组与对照组的滋养层细胞中均有表达(图1)，但实验组的阳性表达明显低于对照组(表2)，二者间差异具有显著性(U=4.445，P＜0.001);滋养层细胞中HPV-DNA检测结果见图2，实验组与对照组分别检出10例与4例，分别占29.4%和11.8%，其差异具有显著性(P=0.039);HPV感染阳性的标本中，实验组E-cadherin的表达水平也低于对照组(表3，P=0.015)。

图1 滋养层细胞中E-cadherin的表达(×400)Fig．1 Immunohistochemical expression of E-cadherin(×400)

表2 流产组与正常组滋养层细胞中E-cadherin的表达Tab．2 Expressions of E-cadherin in trophoblast of recurrent abortions and normal groups

图2 HPV DNA电泳结果Fig．2 The results of HPV DNA detection

表3 E-cadherin在流产组与正常组HPV阳性标本中的表达Tab．3 Expressions of E-cadherin in HPV positive cases of recurrent abortion and normal groups

3 讨论

E-cadherin是一种分子量为120Ku钙依赖性糖蛋白，主要存在于许多细胞表面与细胞外基质，在介导细胞-细胞间粘附及维持组织结构完整性方面起着重要作用。E-cadherin表达的不足将直接影响细胞-细胞、细胞-细胞外基质的粘附，以及细胞骨架的形成，并最终影响组织细胞的生长、浸润[5]。动物实验证明，小鼠E-cadherin基因被敲除后，其胚胎即可停止发育[6]。本实验研究结果显示，早期妊娠复发性流产患者绒毛滋养细胞中E-cadherin的表达水平明显低于正常早孕组(表2)，这提示复发性流产的发生可能与滋养细胞E-cadherin表达不足所导致的滋养细胞迁移、浸润能力下降有关。

绒毛滋养细胞HPV感染与复发性流产是否存在相关性，目前尚缺乏足够证据。早期国内有学者认为，由于HPV非血行传播，且衣壳蛋白质量较大，难于通过胎盘屏障，故对胎儿不构成潜在威胁[7]。最近，Weyn等在流产、早产患者及正常妊娠女性的绒毛滋养细胞中均检出HPV，且认为妊娠早期的滋养细胞对 HPV 较妊娠中、晚期更为易感[8，9]。本次研究结果表明，早期妊娠的复发性流产患者绒毛细胞内HPV感染率(29.4%)明显高于正常早孕组(11.8%)。因此，绒毛滋养细胞HPV感染很可能与复发性流产存在相关性。

目前，关于HPV感染导致复发性流产的机制尚不明确。最近，Selma 等[3]通过 HPV16 E5、E6、E7质粒转染体外培养的绒毛癌 BeWo细胞证实，HPV16能够抑制BeWo细胞的迁移、粘附活性;同时，HPV16 E5、E6、E7蛋白对 E-cadherin基因转录的也有抑制作用[2]。在本实验中，早期妊娠复发性流产患者绒毛细胞内HPV感染率明显高于正常早孕组，而且与正常早孕组相比，复发性流产组中HPV阳性的标本更趋向于E-cadherin低水平表达(表3)。由此推断，流产组绒毛滋养细胞E-cadherin低水平表达可能与HPV感染有关。HPV对E-cadherin基因转录的抑制作用，导致绒毛滋养细胞E-cadherin的表达不足，进而影响绒毛滋养层细胞的迁移、浸润，最终导致流产的发生。

综上所述，可以认为，妊娠早期滋养层细胞E-cadherin的异常表达可能与复发性流产的发生有关，而HPV可能参与这一过程。

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