滋养层干细胞研究进展

张居作，徐君飞，薛立群＊

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.怀化学院生命科学系，湖南怀化418000）

滋养层干细胞已成为研究胎盘发育和功能的理想体外模型，但建立其连续培养细胞库还非常困难。胎盘是所有哺乳动物胎儿赖以存活和发育的器官，在母胎之间承担着气体交换、营养废物运输和信息传递作用，同时对母体起到免疫耐受和激素分泌作用，而哺乳动物的胎盘起始于对胚胎附植、胚胎存活和胎盘发育起关键作用的滋养层干细胞［1］，滋养层干细胞发育异常，可导致胚胎自发性丢失、复发性流产、子痫前期等相关妊娠疾病［2］。滋养层干细胞可从胚胎滋养外胚层直接获得，或通过自发分化、基因敲除和分离胚体等方式诱导胚胎干细胞分化，但自发分化细胞异质性高，不易控制，基因敲除途径只能反映出细胞分化过程中部分标志性基因表达的变化［3］。因此，到目前为止，灵长类动物［4-6］、鼠［7-12］、猪［13-16］、牛［17］和绵羊［18-19］的滋养层干细胞仅能实现分离，培养体系还很不成熟，尚未获得理想的模型，这大大阻碍了后续研究的开展。本文总结了鼠、人、家畜滋养层干细胞的分离方法、培养体系、标志性基因等研究所取得的进展，以期为开展滋养层干细胞研究提供理论基础。

1 鼠滋养层干细胞研究

目前，在滋养层干细胞方面，研究最多、最成熟的是鼠滋养层干细胞模型和培养体系。Tanaka S等［7］最早利用成纤维生长因子4（fibroblast growth factor 4，FGF4）来维持滋养层干细胞的增殖和多能性，所获得的滋养层干细胞能分化成各种滋养层细胞，传代超过50代性状没有明显改变，并推测FGFR2是最佳受体，T-box基因、mEomes基因和尾型同源盒转录因子2基因是FGF4信号路径的下游靶基因。紧接着，Erlebacher A 等［8］在添加有FGF4、转化生长因子（transforming growth factor，TGF-β）或相关因子激活素（activin）的条件培养基中实现了滋养层干细胞的生长、增殖和多能性维持，获得的滋养层干细胞能分化成各种滋养层细胞，进一步验证了FGF4、TGF-β或activin能满足滋养层干细胞的更新增殖，同时获得了2株滋养层干细胞细胞系，这些细胞系表现出上皮样形态，能表达滋养层干细胞标记基因。至此，鼠滋养层干细胞的培养体系已经基本形成，但由于饲养细胞能分泌多种不确定生长因子、不同批次血清成分和含量的波动给研究结果增加了不确定性。为此，Schorle团队开展了较为全面的鼠滋养层干细胞研究［9-11］，形成一套较为成熟的分离培养、标记基因鉴定、增殖和多能性维持及定向分化体系，在 DMEM（Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium）／F12基础培养基中添加10种给定化学物质，实现了滋养层干细胞的无血清培养；同时将获得的滋养层干细胞皮下注射裸鼠，诱导产生了出血性损伤，进一步证实了所获得的滋养层干细胞具备有发展成胎盘的能力。Ohinata Y等［12］对无血清培养基进行进一步优化，发现在DMEM／F12基础培养基中添加 FGF2、activin A、XAV939和Y27632，可维持滋养层干细胞的自我更新增殖和多能性的保持，这种条件下的滋养层干细胞能够表达特定的Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Cdh1、Esrrb、Sox2和Tcfap2c标记基因，在体外能诱导分化成滋养层巨细胞、海绵状滋养层细胞和迷宫滋养层细胞。据此，鼠滋养层干细胞分离方法、培养体系较为完善，但标志性基因研究还有待进一步筛选和确定。

2 人滋养层干细胞研究

由于伦理限制，人的滋养层干细胞材料来源困难，原始滋养层细胞体外分离和长期稳定培养存在一些缺陷；或从成熟胎盘分离出来的滋养层细胞大部分已经定向分化，呈现妊娠多样性［5-6］；或少数多能性细胞缺乏维持多能性的培养条件，也会很快分化，因而人滋养层干细胞的研究一直缺乏成熟的实验模型，到目前为止，对人早期滋养层细胞分化的调节掌握很少。Genbacev O等［4］从绒毛膜直接分离滋养层多能干细胞，采用DMEM／F12基础培养基中补充10ng／mL 的 FGF，100mL／L的 FBS和10μmol／L的SB431542进行细胞培养，由于缺乏合适的维持多能性的条件，极性多能细胞寿命短暂，很快分化形成多核合胞体滋养层细胞和侵袭性细胞滋养层细胞。James J L等［5］发现单层绒毛细胞滋养层培养1周后死亡，锚定绒毛细胞滋养层能产生新的绒毛外滋养层并存活期增加至3周，但不能重新生成合胞体滋养层。James J等［20］对滋养层祖细胞进行研究，采用DMEM／F12基础培养基中补充5 ng／mL的表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），5mg／mL的胰岛素，10mg／mL的转铁蛋白，400U／L的hCG进行细胞培养，获得了绒毛外滋养层祖细胞，但这些细胞是否为滋养层干细胞没有被鉴定。所以，人滋养层干细胞研究还停留在分离方法上，培养体系一直难以建成。

3 家畜滋养层干细胞研究

因猪、牛、羊等家畜的活体采卵难度大、耗时长、花费大，单次获得的胚胎有限，使得其滋养层干细胞的建系较模式动物鼠要困难。

由于猪和人有一些类似的生理机能和非常相似的免疫细胞类群，能够高度保真的复制许多人类疾病，目前研究重症综合性免疫缺陷表明猪可能成为再生医学、遗体器官移植、干细胞治疗和肿瘤发生的重要模型［21］；另外，胚胎自发性丢失的重要原因是胎盘异常或胎盘血管形成异常［21］。因此，对猪滋养层干细胞研究具有重要的意义。Alberio R等［13］从10.5d～12d胚胎中收集外胚层，以DMEM／F12为基础培养基，添加bFGF和β-mercaptoethanol，结果表明，外胚层能够自我更新，维持细胞多能性，表达关键的多能因子OCT4（或POU5F1）、NANOG、SOX2和NODAL，同时能被BMP-4诱导分化为滋养层。Ezashi T等［15］采用基因重编猪纤维母细胞诱导产生干细胞，以DMEM／F12为基础培养基添加FGF2，获得一种能自我更新的多能性滋养层细胞类群，但传代后不能维持一致的表型。宋志强等［16］通过对6d孤雌囊胚透明带进行划口，在饲养层和基础培养液中附加碱性成纤维生长因子（bFGF）和人白血病抑制因子（hLIF），分离得到的细胞呈现上皮样细胞形态，细胞间结合紧密，边缘光滑，核质比较大，表达滋养层干细胞标记基因Cdx2，体现了滋养层干细胞特征。对猪滋养层干细胞的研究主要是借鉴鼠、人滋养层干细胞的一些研究方法和标记基因，通过从早期胚胎外胚层或者体外培养的囊胚获得研究材料，还不能实现连续培养，获得的细胞也存在不确定性。

目前，对牛、羊滋养层干细胞的研究还较少。Ramos-Ibeas P等［17］结合单层培养系统，微滴表面覆盖明胶，以鼠胚胎成纤维细胞为饲养细胞，以支持从活体检查获得胚胎中分离、建立的牛滋养细胞系的生长。所获得的滋养细胞的传代能力超过2年，保持多潜能性性的基因表达模式，展示出一定的自我更新能力。通过研究建成了一套通过牛的胎活体检查获得胚体，体外培养、分离出滋养层细胞的系统，这套系统能解决从很少数量细胞扩增DNA研究牛胚胎基因型和表型的限制，同时建成一个能用于研究围植入期胚胎滋养层细胞的体外模型，但不能实现连续培养，要建成细胞模型还有很多难点需要克服。刘慧等［19］经过培养不同孕期的蒙古绵羊滋养层细胞，通过添加不同浓度血清的高糖DMEM培养体系获得滋养层细胞，细胞形态多样，呈多角形或卵圆形，核圆或呈小泡状；细胞角蛋白呈阳性表达，波形蛋白呈阴性表达；透射电子显微镜观察绵羊绒毛膜滋养层细胞，核较大，胞质内线粒体较多，有电子密度较高的脂滴，细胞表面有丰富的微绒毛，细胞间可见缝隙连接结构，但获得的这些滋养层细胞是否为干细胞没有进一步的鉴定。

4 小结和展望

滋养层干细胞来自早期胚胎，在胚胎发育的过程中分化为特定的滋养层细胞类型，是胎盘形成的重要组成［22-23］，这些细胞包括滋养层巨细胞、海绵滋养层细胞、糖原滋养层细胞和合胞体滋养层细胞。但哺乳动物胎盘类型存在差异，滋养层细胞类型不同，滋养层干细胞的获得是开展进一步研究的基础，然而滋养层干细胞的获得、培养方法和标记基因的研究还处于探索阶段。虽然鼠滋养层干细胞的研究已经取得了突破性进展，为其他动物滋养层干细胞的研究提供了借鉴，但细胞物种差异性决定了不是所有的动物都与鼠类似，因而研究需要根据动物的滋养层细胞的特征，发育过程和生理功能，选择合适的时间点、维持细胞多能性的物质和标记基因。

培养体系中添加血清、生长因子，培养器皿包被基质，给予饲养层细胞等能够使细胞很好的存活下来。但是，血清成分的不确定性，培养基中是否添加血清一直存在争议，更多的观点支持不加血清；饲养细胞分泌的生长因子不确定，多数观点建议采用纤维蛋白包被或者基质胶包被，也有对培养器皿进行处理存在不同观点；添加的生长因子多种多样，主要有FGF、EGF、activin A、Heparin和β-mercaptoethanol，不同研究者有不同的选择偏好性，这些不确定性和偏好性选择可能改变了获得细胞的特性，可能已经分化为终端细胞类型。

标记基因的选择主要由三个方面决定：是否与胎盘早期发育密切相关，基因沉默或者过表达对分化方向产生决定性的影响，基因的表达和表观效应是否作为滋养层干细胞干性转录因子网络成员的角色相对应［3］。但是在实际应用中受到了物种、时间点选择的影响，标记基因的选择也存在不确定性，对多能性标记基因 Cdx2、Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Cdh1、Esrrb、Sox2、cfap2c、CK7、CD9 、CGb、SSEA-1、合胞体蛋白2和Mamu-AG的选择同样也存在偏好性，是否适用于所有物种？不同物种滋养层干细胞的形态学观察结果有差异，是观察时机的选择造成（是否已经分化），还是形态学不同？这些疑问有待进一步阐明，利用滋养层干细胞来研究胎盘形成和胎盘免疫屏障是必然选择，将为解决妊娠综合症、子痫前期、胎儿生长受限、流产、死胎等问题提供理论基础。

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