EDTA联合抗菌药对水霉菌生物膜的影响

袁海兰，欧仁建，胡 鲲，杨先乐＊

（1.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海201306；2.成都市龙泉驿区水务局，四川成都610100）

生物膜（biofilm）是一种附着于活组织或无活力的组织表面、由其自身产生的细胞外多聚基质（extracellular maxtrix，ECM）包裹的有结构的菌细胞群体，由ECM及被其粘连的菌细胞构成。它是相对于游离状态菌细胞而言的另一种微生物的存在方式，可以保护菌细胞，有利于微生物抵抗外界不利因素［1-2］。水霉菌（Saprolegnia）是引起鱼类发生水霉病的主要病原，其适应温度范围广，分布范围亦很广，一年四季都可以引起鱼类发病［3］，水霉病给水产养殖业造成巨大经济损失。且自孔雀石绿禁用以来还没有一种有效的药物用以治疗水霉病。Ali S E等［4］于2013年首次报道水霉菌可以形成生物膜，水霉菌菌丝及相关繁殖体完全被包裹在胞外基质中，胞外基质能协助生物膜逃逸宿主的免疫并阻止药物的渗透，使在施用药物后，水霉菌仍可在生物膜中大量存活、生长和繁殖，从而对水产动物构成持续不断的感染。

有研究表明，金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）对生物膜主要成分胞外基质有破坏作用，且与抗菌药物联合使用杀菌效果更显著，或将成为一种潜在的治疗生物膜相关病原感染的药物［5-6］。本研究探索EDTA和两种生产中常见防治水霉病药物联合对水霉菌生物膜的清除作用，以期为水霉病的治疗寻找新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 水霉菌株，寄生水霉（Saprolegnia parasitica）ATCC200013（1990年，分离自日本神奈川患水霉病的虹鳟）来自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）。

1.1.2 试剂 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、亚甲基蓝、EDTA-2Na·2H2O为国药集团化学有限公司产品；美婷为上海海洋大学国家水生动物病原库提供，其主要成分为立达霉；沙氏葡萄糖液体培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司产品；细胞计数试剂盒CCK-8（Cell Counting Kit-8）为碧云天生物技术研究所产品；荧光染色剂Calcofluor White M2RTinopal UNPA-GX为Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 EDTA对水霉菌游动孢子最小抑菌浓度菌种接种在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平皿上，20℃将菌种活化。然后在平皿上铺满油菜籽，待菌丝长上菜籽，将菜籽移至灭菌蒸馏水中。20℃培养48h，待游动孢子大量产生后，用3层灭菌纱布过滤弃去油菜籽，离心收集水霉菌孢子，血球计数板计数，将孢子浓度调至2×106个／mL。

采用微量稀释法，使EDTA终浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098、0.049、0.025mg／mL，测定EDTA 对水霉菌游动孢子的最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.2 水霉菌生物膜体外构建 在培养板中预先放入大小一致的无菌聚乙烯网片。将0.5mL孢子悬液和0.5mL沙氏葡萄糖液体培养基加入到24孔培养板中，20℃培养60h，体外构建水霉菌生物膜［7］。

1.2.3 EDTA单独及联合抗菌药使用对水霉菌生物膜的作用

1.2.3.1 药物作用（1）抗菌药的作用。生物膜培养60h后，用移液器吸出培养基，并用灭菌PBS清洗3次以去除游离菌。药物试验组为亚甲基蓝组20mg／L，40mg／L；美婷组10mg／L，20mg／L。分别添加1mL，20℃培养2h。以不添加药物而加入无菌水作对照。试验重复2次。（2）EDTA单独使用对生物膜的作用。生物膜培养60h后，用移液器吸出培养基，并用灭菌PBS清洗3次以去除游离菌。分别添加1mL浓度为1、4、16倍 MIC的EDTA。（3）联合作用。分别添加20mg／L亚甲基蓝、10mg／L美婷及 EDTA 终浓度为1、4、16MIC EDTA于成熟的水霉菌生物膜，20℃培养2h。

1.2.3.2 药物作用后活菌量的检测 按照试剂盒的说明使用CCK-8工作液。药物作用后水霉菌生物膜洗涤后（亚甲基蓝处理组需多次洗涤除去颜色），加入沙氏葡萄糖液体培养基和CCK-8工作液，放入28℃恒温孵箱中培养3h，然后将反应液平分在96孔板中，用酶标仪测定每孔在450nm处的OD值。实际OD值为每个试验孔的吸光度值减去空白对照孔的OD值。

1.2.4 EDTA对生物膜结构的影响 清洗后的水霉菌生物膜分成两组：空白组置于灭菌PBS中，试验组放于16MIC的EDTA中作用后，灭菌PBS漂洗3遍，加200μL荧光染料Calcofluor White M2R（0.05%）避光染色1min，冲洗后放置在载玻片上，倒置荧光显微镜下观察［8］。

1.2.5 统计学分析 结果以平均数±标准差表示，用EXCEL、SPSS 13.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 药物对水霉菌生物膜的作用

2.1.1 抗菌药 从图1可以看出，水霉菌生物膜形成之后，抗菌药亚甲基蓝、美婷在常用剂量下作用效果不佳，与对照组无显著差异（P＞0.05），当药物浓度提高到2倍时亚甲基蓝仍没有表现出显著作用，与对照组无显著差异（P＞0.05）。

图1 抗水霉菌药物作用后水霉菌生物膜OD 450nm值Fig.1 OD 450nm values of Saprolegniabiofilms under different anti-Saprolegniadrugs

2.1.2 EDTA单独及与抗菌药联合使用 用EDTA对水霉菌游动孢子的最小抑菌浓度的1、4、16倍浓度（即1、4、16MIC）作用于成熟的水霉菌生物膜。从图2和图3可以看出，1MIC作用下对水霉菌生物膜无显著影响（P＞0.05）。随着EDTA的浓度升高，4MIC和16MIC对水霉菌生物膜有显著的破坏作用，且当EDTA与亚甲基蓝或美婷联合使用时，效果更佳，与两者的单独使用有显著差异（P＜0.05）。

2.2 EDTA作用后水霉菌生物膜胞外基质变化

图4A可以看出未加干预的成熟生物膜胞外基质含量密集、呈云雾状团集，构成了生物膜的基质。而EDTA作用后胞外基质明显减少，呈小块状分散（图4B）。

3 讨论

水霉病是困扰水产养殖业的重要疾病，一直以来主要用化学药物治疗。由于孔雀石绿在鱼体内残留时间长，具有高毒素、高残留等副作用，在全国禁用，由此水霉病的预防与治疗又成为养殖界的难题［3］。目前，水产养殖中主要使用亚甲基蓝、美婷防控水霉病，但是水霉病并没有得到全面控制。其原因可能是在水霉病暴发初期药物作用明显，当水霉菌形成生物膜后，药物作用效果降低。如本研究所示，水霉菌生物膜一旦形成，水霉菌对常用剂量下亚甲基蓝和美婷不敏感，这与其对水霉菌菌丝的抑制及影响孢子释放结果不一致；而使用2倍剂量时，美婷表现出一定的杀菌作用，亚甲基蓝作用效果不佳。Ali S E等［4］使用2mg／L孔雀石绿及100mg／L溴硝醇处理水霉菌生物膜，并用大麻籽诱生药物处理后的生物膜，结果大麻籽上重新长出游动孢子囊并释放游动孢子，说明水霉菌被致密的生物膜结构保护，即使在有效的药物治疗后仍能存活、繁殖。生物膜的形成对药物的作用效果有极大的影响，且这种影响在生物膜形成的早期（黏附期）就出现，并且随生物膜的成熟而增强，生物膜越成熟，就影响越大［1］。

图2 EDTA单独及与亚甲基蓝联合用药后水霉菌生物膜的OD 450nm值Fig.2 OD 450nm values of Saprolegniabiofilms under EDTA alone and combination with methylene blue

图3 EDTA单独及与美婷联合用药后水霉菌生物膜的OD 450nm值Fig.3 OD 450nm values of Saprolegniabiofilms under EDTA alone and combinationwith Meiting

图4 EDTA作用后水霉菌生物膜胞外多糖的变化Fig.4 The change of exopolysaccharide of Saprolegniabiofilms after EDTA treatment

抗菌药物要对生物膜中菌体及其组分发挥作用的前提是必须渗透进入生物膜［9-10］。研究表明，单独抗生素给药并无法渗透入生物膜内部。寻找新的辅助药物，以利于抗生素对生物膜发挥更大的作用是很有必要的。Devine D A 等［5］和 Kite P 等［6］研究显示二价阳离子螯合剂EDTA能广泛减少细菌及真菌生物膜微菌落。Emma J等［11］在研究EDTA对隐球菌生物膜形成的影响时发现EDTA可能通过影响钙镁离子运输抑制隐球菌，同时减少生物膜中隐球菌细胞分泌。本文首先测定了各种浓度的EDTA对水霉菌的抑菌作用，再联合常用的抗菌药处理水霉菌生物膜，结果显示联合用药作用效果明显优于美婷及亚甲基蓝单独使用，联合用药能较好地清除水霉菌生物膜。对EDTA处理后生物膜胞外基质染色，观察发现水霉菌生物膜胞外基质被分散，菌丝暴露。可见EDTA本身对形成生物膜的水霉菌有杀菌作用，并且可以破坏生物膜结构、促进抗菌药物的渗透，两者合用可发挥显著的抗生物膜活性。

EDTA作为一种金属离子的鳌合剂，引入水生生物培养已有40多年了，如用于藻类和海洋无脊椎动物的培养和育苗，起到保持某些元素溶解度及降低金属离子毒性的作用，EDTA对水生生物的存活、生长及养殖环境的改善有一定作用［12］。而本研究结果表明，EDTA与抗菌药联合使用有望成为一种根除水霉菌生物膜感染的好方法，然而其使用剂量和应用安全性及有待于更进一步的研究。

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