市售载玻片涂制疟原虫检测血涂片质量的比较

吕全 孙晓东 许时燕

在临床医学中，血涂片的显微镜检查是血液细胞学检查的基本方法[1]，对多种血液疾病的诊断具有重要价值[2]。血涂片镜检法迄今仍是疟疾诊断最直接可靠的方法[3]，是疟原虫检测金标准[4-5]，也是我国消除疟疾行动计划推荐疟疾诊断方法[6]。但是，血涂片的制备和染色不良，常使细胞形态结构鉴别发生困难，甚至导致错误结论。WHO建议正在消除疟疾的国家应维持有质量保证的疟原虫镜检能力[7]，《疟原虫检测 血涂片镜检法（WS/T 569—2017）》行业标准[8]的颁布，为疟原虫检测的血涂片制作与染色提供了统一的标准[5，9]，但未详细规定载玻片的清洁标准，载玻片清洁与否从而成为影响疟原虫镜检质量的关键环节。为了解市售不同预清洁载玻片涂制血涂片的质量，为保障疟原虫镜检质量提供科学依据，2018年9月开展本项研究，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

（1）血样。实验前用肝素钠真空采血管采集1名研究者静脉血2 mL，采血管上下颠倒5次混均抗凝剂。

（2）载玻片。在互联网上查阅或咨询不同厂家和不同品牌载玻片的预清洁资料，收集市售不同预清洁新载玻片各50张。

1.2 研究方法

（1）对照载玻片。从本实验室库存的清洁级（clear glass）载玻片随机抽取20张浸入有洗洁精的清水中浸泡30 min，用脱脂纱布逐一擦拭后用清水冲洗干净，晾干后再用脱脂纱布将载玻片擦亮作为对照载玻片。

（2）血涂片制作。收集的每种载玻片各随机抽取20张以及对照载玻片20张，用定量移液器取血1 μL为薄血膜血量，取4 μL为厚血膜血量，由本实验室1名疟疾专业技术人员按国家标准[8]用推片逐一涂制疟原虫检测血涂片，其中厚血膜涂成直径1 cm圆形，薄血膜涂成宽2 cm×长2.5 cm舌型，每片血涂片用记号笔标记载玻片预清洁等级和编号。

（3）血涂片染色。吉姆萨染液原液和pH7.2磷酸盐缓冲液由本实验室提供。血涂片自然阴干和薄血膜用甲醇溶液固定后，按国家标准规定的成批血涂片染色法[8]，用10槽玻璃染色缸加入2%吉氏工作液背靠背的染色20张血片，30 min后冲洗晾干。

1.3 观察指标

2人盲法观察每张染色血涂片，分别计数厚薄血膜上的针孔空洞数（空洞直径＜0.5 mm）,油斑空洞数（空洞直径明显较针孔空洞大或直径≥0.5 mm）和血膜脱落数，计数结果记录在登记表。

1.4 统计学方法

用EXCEL 2010建立数据库，用SPSS 17.0软件进行描述性统计分析，油斑空洞计算载玻片出现率以（%）表示，不同载玻片针孔空洞数进行正态性检验和方差齐性检验后用t检验分析差异显著性，显著水平α=0.05。

2 结果

2.1 载玻片

共收集4种载玻片，100%为即用型预清洁载玻片，预清洁等级分为清洁级（clear glass）、标准级（standard grade）、超级（super grade）和病理级（pathology grade）。

2.2 质量观察

共染色100张血涂片，其中4种预清洁和对照载玻片共5种载玻片各染色20张。100张染色血涂片中，累计97张出现335个针孔空洞，3张对照载玻片未出现空洞，针孔空洞总出现率为97%（97/100），平均（3.35±1.77）个；5种载玻片涂制的血涂片针孔空洞数均呈正态分布（P＞0.05），方差齐（P=0.203），5种载玻片针孔空洞数间比较差异有统计学意义（P＜0.01）；4种预清洁载玻片涂制的血涂片针孔空洞数均多于对照载玻片，比较差异均有统计学意义（P＜0.01），其中超级清洁载玻片针孔空洞平均数最高（4.85±1.57）个。2张超级清洁载玻片涂制的血涂片分别出现油斑空洞1个和3个，空洞直径均＜1 mm。油斑空洞总出现率为2%（2/100）。血膜脱落率为0。血涂片质量观察结果见表1。

3 讨论

用显微镜观察标本时用来放标本的玻璃片通常称为显微载玻片,其分类方法众多,例如，按是否预清洁分为免洗载玻片和未免洗载玻片，按是否防脱分为普通载玻片和黏附载玻片，按能否做记号分为记号载玻片和普通载玻片，以及磨砂边和抛光边等。本研究中，笔者参照疟疾临床诊断和监测的实际应用而收集普通显微载玻片，100%为即用型预清洁载玻片，其预清洁等级是按玻片盒上中文或英文标注归类为清洁、标准、超级和病理级4种预清洁等级，但其清洁分级标准未查阅到相关文献和资料。

WHO建议选择质量好的载玻片来涂制疟原虫检测血涂片[10]，而霉变、灰尘和油污等低质量载玻片将导致血膜脱落、涂片和染色质量差，从而影响疟原虫镜检质量，载玻片无论预清洁与否，涂制血涂片前必须清洗清洁和分包保存。然而我国新近颁布实施的《疟原虫检测 血涂片镜检法》（WS/T 569—2017）国家标准未对载玻片的清洗清洁做详细的规定，仅要求载玻片为无划痕无油污的洁净载玻片[8]。本研究收集到的4种载玻片100%为预清洁免洗载玻片，其中病理级载玻片采用塑料袋真空包装，防霉效果略好于其余3种用塑料薄膜包装载玻片。

针孔空洞普遍存在于薄血膜，肉眼观察薄血膜常见细小的空洞无规律的分布于薄血膜，偶见厚血膜。研究发现血涂片针孔空洞出现率为97%，平均（3.35±1.77）个，甚至用洗洁精清洗过的对照载玻片出现率也高达85%（17/20），但清洗过的载玻片针孔空洞数明显少于未清洗载玻片（P＜0.01），平均（1.75±1.12）个。研究同时发现仅针孔空洞数最多的超级清洁载玻片出现油斑空洞（10%），说明针孔空洞和油斑空洞均与载玻片上的油污有关，针孔空洞数越多，油斑出现的概率越大，而常用的洗洁精浸泡清洗方法不能完全清除载玻片表面油污。显微镜油镜下观察薄血膜油斑空洞周围红细胞堆积变形明显，这在疟原虫检测时会影响疟原虫虫种判定和密度计数[10]，而针孔空洞周围红细胞重叠不明显，不影响镜检质量也不影响薄血膜整体外观。本研究随机抽取的100张载玻片未发现明细划痕，染色的厚薄血膜也无血膜脱落。因此，新载玻片在未清洗清洁的情况下，除了超级清洁级载玻片外，其余3种预清洁载玻片涂制的疟原虫检测血涂片满足消除疟疾临床诊断和监测质量要求。

表1 不同预清洁载玻片涂制疟原虫检测血涂片质量比较

血膜制作和染色是影响疟原虫镜检质量的关键因素[11-12]，但随着即用型载玻片应用，临床检验中往往忽略了玻片质量的把关[13]。本研究发现市售的显微载玻片大部分预清洁质量尚可，在现场工作中可根据针孔空洞数和油斑空洞数预判载玻片的清洁质量，一旦出现油斑空洞，该批载玻片建议清洗清洁后再用于涂制血涂片，而用于制作教学和疟原虫血涂片资源库储存时，新载玻片建议须清洗清洁，但清洗方法尚需改进。