水中诺如病毒切向流超滤富集方法的研究

王建 陈秋霞 宋曼丹 杨冰 朱海明 谭慧嘉

诺如病毒（norovirus），又称诺瓦克病毒，可引起急性胃肠炎，是非细菌性腹泻暴发的主要病原体。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播。如果污染了水源，传播速度更快，波及范围更广，对人民群众的健康危害更大。近年水源性诺如病毒感染疫情的暴发在国内时有报道[1-4]。诺如病毒在环境中尤其在水中的浓度很低，难以直接检出，因此能否浓缩大量水体中微量病毒粒子是病毒检测的关键环节。切向流超滤是指液体在泵的驱动下，沿着与膜表面相切的方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过超滤膜；而另一部分液体切向地流过膜的表面，将被膜截留的大分子物质和颗粒冲走，在系统中循环超滤，从而达到富集浓缩的效果。整个过程中液体以一定的速度连续流过膜的表面，过滤的同时也对膜表面进行了冲刷，避免膜的堵塞和流速下降。因此，切向流超滤膜适合检测大体积水样，并可反复使用。本研究用Pellicon 2 MINI切向流超滤膜包进行第一次富集水样，并结合PEG进行二次富集（Pellicon-PEG富集法），以提高诺如病毒检测的灵敏度和浓缩效率，为水源性诺如病毒食物中毒暴发案例快速、准确地提供实验室证据，同时也为水中的诺如病毒监测提供快速、准确的实验室数据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 粪便标本 诺如病毒阳性标本，由本实验室保存，经Real-time PCR 检测确认为诺如病毒GⅡ型的粪便标本，用磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液稀释成10%的粪便悬液，-80℃保存。

1.1.2 主要仪器与试剂 实时荧光PCR仪（ABI QuantStudio7）、超滤系统（Mini-Pellicon）、高速冷冻离心机。

QIAamp Viral RNA Mini kit购自上海凯杰企业管理有限公司，RT-qPCR Mix（Taqman，50℃）试剂盒、诺如病毒标准系列（GⅠ/GⅡ）定量试剂盒、MS2引物探针试剂盒（CY5）、NoV GⅡ外加扩增控制RNA 均购自北京良润生物科技有限公司，PEG8000购自生工生物工程（上海）股份有限公司，NoV GⅡ引物及探针由上海英骏生物技术有限公司合成，Pellicon 2 MINI超滤膜包购自密理博（中国）有限公司。

5×PEG 8000/NaCl溶液的配制：NaCl 87 g，PEG 8000 500 g，加入1 000 mL 水加热溶解，高压灭菌。

1.2 方法

1.2.1 MS2及病毒浓缩富集 Pellicon 2 MINI超滤膜包（第一次富集）：用PBS将粪便悬液进行10倍梯度稀释，配制成浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的粪便稀释液。将100 μL系列粪便稀释液分别加入10 L纯水中作为模拟水样，同时加入10μL MS2（Phage MS2，大肠杆菌噬菌体MS2）作为过程控制病毒，混匀。将模拟水样以500 mL/min的速度通过一个Pellicon 2MINI超滤膜包，滤过水的速率为260 mL/min，40 min后收集到

80～100 mL水样浓缩液。

PEG富集（第二次富集）：在第一次富集所得的水样浓缩液中加入其2.5倍体积的5×PEG 8000/NaCl溶液，4℃过夜沉淀，在4℃、10 000 g离心力条件下离心30 min，弃去上清，继续离心5 min使沉淀紧凑。用1 000 μL PBS重悬沉淀，得二次富集水样待提取RNA。

1.2.2 RNA提取 在1.5 mL 离心管中加入560 μL Buffer AVL（已加入Carrier RNA）和200 μL病毒浓缩液，按照QIAamp Viral RNA Mini kit试剂盒说明书进行RNA提取操作，得到50 μL RNA洗脱液。

1.2.3 粪便稀释液及模拟水样NoV GⅡ浓度的计算 按照QIAamp Viral RNA Mini kit试剂盒说明书，对粪便悬液稀释系列10-1、10-2、10-3、10-4、10-5进行RNA提取，分别取5μL检测。用诺如病毒标准系列（GⅠ/GⅡ）定量试剂盒的GⅡ标准品制作标准曲线，其浓度为106Copies/μL，将其10倍稀释成106、105、104、103、102、101、100，分别取 5 μL检测，以RNA 浓度lg值为x轴，以其循环阈值（Ct）为y轴，建立标准曲线。粪便稀释液NoV GⅡ的浓度为（QuantStudio™ Real-Time PCR Software软件计算浓度/4）。模拟水样NoV GⅡ的浓度为（粪便稀释液NoV GⅡ浓度×粪便稀释液加标体积）/模拟水样体积。

1.2.4 回收率的计算 以水样中添加的MS2作为病毒提取的过程控制，用于计算病毒回收率。按照MS2过程控制试剂盒说明书提取 RNA，10 倍稀释配制成为 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5标准系列，分别取5 μL检测，以RNA浓度lg值为x轴，以其循环阈值（Ct）为y轴，建立标准曲线。每份水样中加入10 μL MS2过程控制，得到1 000 μL病毒富集浓缩液，取200 μL提取RNA，最终得到50 μL洗脱液，取5 μL检测。则回收率（%）为1 mL水样浓缩液的MS2拷贝数/（MS2原液浓度×MS2加标体积）×100%。

1.2.5 实时荧光RT-PCR反应及质量控制 反应条件：NoV GⅡ的引物探针序列参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验GB 4789.42-2016》[5]，均配制成10 μmol/L。MS2的引物探针由MS2引物探针试剂盒（CY5）提供。使用RT-qPCR Mix（Taqman，50℃）试剂盒进行Real-time PCR反应，反应条件为：50℃逆转录30 min；95℃预热5 min；95℃变性15 s，60℃退火、延伸30 s，65℃延伸30 s，45个循环，60℃采集荧光信号。反应体系依照产品说明书。

质量控制：计算MS2的回收率作为实验NoV GⅡ的病毒的提取效率，为病毒提取过程控制，要求回收率≥1%；通过外加扩增控制NoV GⅡ RNA,计算抑制指数,作为扩增控制，要求抑制指数≤2；同时以无RNase超纯水作为空白对照，以PBS提取RNA,作为阴性对照，以外加扩增控制NoV GⅡ RNA ,作为阳性对照[5]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，用配对t检验对NoV GⅡ和MS2的回收率进行比较。相关性分析结果由real-time pcr仪自动计算得出。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NoV GⅡ污染水体各稀释梯度的灵敏度

2.1.1 NoV GⅡ Real-time PCR标准曲线的建立 用100～107Copies/μL的GⅡ质粒标准品建立标准曲线，以检测粪便病毒稀释液NoV GⅡ病毒以及过滤后富集水样NoV GⅡ病毒的绝对定量。7个点具有良好的线性关系，斜率为-3.196，相关系数R2值为0.999，见图1。

图1 GⅡ质粒标准品标准曲线

2.1.2 Pellicon-PEG富集法富集病毒的灵敏度及回收率（模拟水样NoV GⅡ的最低检出浓度） 各稀释梯度的粪便稀释液的模拟水样样均进行5次实验，当模拟水样中NoV GⅡ的浓度大于10-4Copies/μL时，经Pellicon-PEG富集法富集后均可检出NoV GⅡ病毒，此方法的检测灵敏度为10-4Copies/μL；NoV GⅡ的回收率均大于1%，见表1。

2.2 Pellicon-PEG富集法富集病毒的回收率

2.2.1 MS2 Real-time PCR标准曲线的建立 以10-5～100Copies/μL的MS标准品建立标准曲线，以检测水中MS2的绝对定量。6个点具有良好的线性关系，斜率为-3.465，相关系数R2值为0.992，见图2。

2.2.2 MS2回收率 各稀释梯度模拟水样MS2的回收率在10%～20%，各稀释梯度的平均回收率分别为16.5%、15.7%、12.8%、12.1%、15.3%，见表2。NoV GⅡ的检测灵敏度是10-4Copies/μL，对表1中粪悬液稀释梯度大于10-4Copies/μL的NoV GⅡ平均回收率为（16.3±5.7）%，和表2粪悬液稀释梯度大于10-4Copies/μL的MS2平均回收率（15.0±5.3）%进行配对t检验比较，两者差异无统计学意义（t=-1.617，P=0.128）。

图2 MS2标准曲线

2.3 抑制指数

各稀释梯度模拟水样二次富集浓度液的抑制指数均小于2，见表3。

3 讨论

检测水中诺如病毒，富集效率是关键因素。水中病毒的富集方法有很多种，目前水样浓缩常用的方法有膜过滤法、吸附-洗脱法、絮凝沉淀法、超速离心法、免疫磁珠分离法、超滤法。这几种方法或价格昂贵、难于推广，或方法复杂、需要特殊仪器，或富集时间长，不适合大体积水样的检测[6-8]。本实验应用Pellicon-PEG富集法，可将10 L水样浓缩成1 mL,浓缩倍数为10 000，浓缩时间为40 min。与其他水富集方法比较，在检测大体积水样时，Pellicon-PEG富集法的浓缩体积、倍数及实验时间均优于其他富集方法。

表1 Pellicon-PEG富集法检测NoV GⅡ的灵敏度及回收率

表2 Pellicon-PEG富集法富集病毒的回收率（%）

表3 Pellicon-PEG富集法富集病毒的抑制指数

诺如病毒在水中的含量很低，但有很强致病力和感染力，几个病毒即可致病[9]。比较常用的几种水样富集方法，其最高检测灵敏度在 101～ 102Copies/μL[8，10-15]，而 Pellicon-PEG 富集法的最高检测灵敏度可达10-4Copies/μL，对于检测诺如病毒含量极低的水样，Pellicon-PEG富集法优于其他富集方法。MS2的回收率与NoV GⅡ的回收率无显著性差异，可在实验中作为过程对照病毒，以估算诺如病毒的回收效率。本实验的MS2回收率在10%～20%，抑制指数均小于2，符合《食品安全国家标准 食品微生物学检验GB 4789.42-2016》的要求[5]。

综上所述，Pellicon-PEG富集法具有浓缩倍数高、富集时间短、检出灵敏度高、经济成本低、可检测大体积水样等优点，期望为提高水源性诺如病毒胃肠炎疫情暴发实验室检测能力奠定基础。本实验拟下一步采集河水、污水、养殖水等水样，建立不同水体的Pellicon-PEG富集检测方法。