河南省首例输入性诺氏疟的诊断和分析

周瑞敏，李素华，高丽君，钱 丹，杨成运，刘 颖，赵玉玲，张红卫

河南省疾病预防控制中心；河南省传染病病原生物重点实验室 郑州450016

诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)在自然界中主要寄生于猕猴体内，20世纪30年代早期，印度加尔各答热带医学院首次发现并对其进行了研究，其可通过血液传染给人类[1-3]。1954年，Chin等[4]报道了第一例人类自然感染诺氏疟原虫病例，为美国陆军的一名调查员在马来西亚森林中工作时感染。人类自然感染诺氏疟原虫一直被认为非常少见，直到2004年Singh等[5]应用分子生物学技术对马来西亚婆罗洲镜检阳性的疟疾病例进行检测，发现许多患者为诺氏疟原虫感染，证实了人类自然感染诺氏疟原虫的普遍存在。此后，几乎东南亚所有国家都有人类自然感染诺氏疟原虫的报道，诺氏疟原虫亦被认为是感染人类的第五种疟原虫[6-8]。

我国曾有多位学者报道过非典型形态的间日疟原虫感染，如间日疟原虫多核亚种，但缺乏分子生物学证据[9]。2006年，朱淮民等[10-11]对云南省墨江县1998年缅甸输入的“间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染”患者血涂片进行回顾性复查，发现其形态特异，经分子生物学技术检测确诊为诺氏疟原虫感染。2014年10月，潘波等[12]报道了广东省首例输入性诺氏疟原虫感染病例，患者从马来西亚旅游回国。2017年10月，河南省确诊省内首例输入性诺氏疟原虫感染病例，也为我国第三例输入性诺氏疟原虫感染病例，现报道如下。

1 材料与方法

1.1样本来源由河南省疟疾诊断参比实验室收集疟疾患者的样本进行实验室复核，主要包括有厚、薄血膜的血涂片和治疗前采集的EDTA抗凝血，血涂片室温保存，血液样本-80 ℃保存。样本的采集和流行病学调查均获得了患者的知情同意。

1.2疟原虫检测血涂片的制作和疟原虫检测方法参照《疟疾的诊断》标准(WS 259-2015)。检测厚血膜确定为疟原虫阳性后，通过薄血膜上虫体形态确定虫种。

1.3疟原虫抗原检测采用快速诊断实验(rapid diagnostic test, RDT)进行抗原检测。万孚疟原虫快速检测试剂盒和CareStartTM疟原虫快速检测试剂盒分别购自广州万孚生物技术股份有限公司和美国Access Bio公司。按照试剂盒使用说明书对EDTA抗凝血样进行检测。

1.4疟原虫18SrRNA的检测及序列分析采用巢式PCR法检测。核酸提取试剂盒购自德国Qiagen公司，PCR 反应预混液购自美国Promega公司，核酸电泳DNA标志物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，Gold view核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司，琼脂糖为西班牙Biowest公司产品。从血液样本中提取疟原虫基因组DNA，-20 ℃保存备用。按照参考文献[4]合成针对疟原虫18S rRNA的引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用属特异性引物rPLU1和rPLU5进行第一轮PCR扩增，反应体系为：2×PCR 预混液 10 μL，上、下游引物(10 mol/μL)各0.6 μL，模板DNA 2 μL，用ddH2O补至20 μL。反应条件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，共35个循环；72 ℃5 min。将第一轮PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，采用ChromasPro软件将序列进行拼接，将所得序列在GenBank数据库中通过BLAST进行同源性比较。采用虫种特异性引物进行第二轮PCR扩增，引物分别为间日疟原虫rV1V1和rV1V2、恶性疟原虫rFAL1和rFAL2、三日疟原虫rMAL1和rMAL2、卵形疟原虫rOVA1和rOVA2、诺氏疟原虫Pmk8和Pmkr9，以第一轮产物为模板，反应体系同第一轮，反应条件同第一轮但退火温度改为58 ℃。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统观察结果。

1.5诊断与治疗按照我国现行《疟疾的诊断》标准(WS 259-2015)进行诊断。结合2015年世界卫生组织推荐的《抗疟药物使用指南》(第三版)和我国《抗疟药物使用规范》(WS/T 485-2016)对患者进行正规治疗：给予磷酸氯喹和磷酸伯氨喹8 d疗法，服药后1周再口服双氢青蒿素磷酸哌喹片。

2 结果

2.1患者基本情况周某，男，51岁，河南省信阳市罗山县人，于2017年3月到印度尼西亚从事木材加工工作，工作地点位于森林附近，自述经常能见到猴子(具体品种不详)出没，但无近距离接触。患者2017年9月11日回国，19日出现发热症状，每天夜间发作，体温最高达39.8 ℃，伴有出汗和畏寒，无其他不适症状，在本村诊所按照感冒治疗数日后未见好转，经另外一名乡村医生建议到该县疾病预防控制中心进行疟原虫检查。采集末梢静脉血制作血涂片，吉姆萨染色后镜检发现疟原虫，诊断为三日疟原虫感染。患者血液样本送至河南省疾病预防控制中心疟疾诊断参比实验室进行镜检、RDT和PCR复核，确诊为诺氏疟原虫感染。患者曾于2014年7月至2016年1月在埃塞俄比亚务工，但否认期间有疟疾史；在印度尼西亚务工期间亦未患疟疾；近期无输血史。

2.2实验室检测

2.2.1 镜检结果 见图1。薄血膜中，被诺氏疟原虫寄生的红细胞不胀大，早期滋养体的形态特征与恶性疟原虫相似，虫体较小，具有双核和一个红细胞多个疟原虫寄生；其他阶段的形态特征则和三日疟原虫相似，疟色素出现较早，呈黑褐色，颗粒粗大，与细胞质交织在一起；晚期滋养体有成带状发展趋势或形成阿米巴样。厚血膜中，早期滋养体形态与恶性疟原虫相似，而其他阶段形态与三日疟原虫相似。故通过镜检很难准确识别诺氏疟原虫的形态。

A～C：薄血膜；D～E：厚血膜图1 血涂片中诺氏疟原虫形态(×1 000)

2.2.2 RDT 疟原虫抗原检测结果均为阴性。

2.2.3 疟原虫18S rRNA的检测 第一轮PCR产物长度约为1 600 bp，同源性比对结果显示与GenBank中诺氏疟原虫18S rRNA部分基因序列(GenBank登录号为DQ350266.1、L07560.1和AY327554.1)的一致性达99%。所得序列已提交GenBank(登录号为MG570077)。采用诺氏疟原虫虫种特异性引物Pmk8和Pmkr9进行第二轮扩增，在152 bp位置处有一特异性扩增条带，与预期大小一致；而采用其他4种疟原虫虫种特异性引物未扩增出目的条带(图2)。

1、4、7、10、13：患者样本；2、5、8、11：分别为间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫阳性对照；3、6、9、12、14：阴性对照；M：DNA标志物

图2巢式PCR

2.3诊断与治疗结合患者临床表现、流行病学史和实验室检查结果，确诊为境外输入性诺氏疟原虫感染病例。治疗后经血涂片镜检未发现疟原虫。1个月后电话回访，未发现异常。

3 讨论

1932年，诺氏疟原虫被发现并命名后，Knowlesi和Gupta[1]对其进行了更深入的研究，通过人体实验观察到3名感染诺氏疟原虫的患者呈现每天发热的周期性。本研究中该患者每天夜间发热，伴有出汗和畏寒，有诺氏疟原虫感染的典型临床表现，同时该患者在森林附近工作，具有流行病学史，怀疑为自然感染的诺氏疟原虫病例，需进一步通过实验室检测确诊。

镜检作为疟原虫检测的金标准被广泛应用，但也常常因血涂片制作染色差、原虫密度低、虫体变形或形态的相似性等原因发生误诊或漏诊。该患者最初被诊断为三日疟，经形态学观察，早期滋养体的形特征与恶性疟原虫相似，其他阶段的形态特征则和三日疟原虫相似。1932年，Knowlesi和Gupta[1]首次提出了诺氏疟原虫和三日疟原虫在形态上有相似性。Cox-Singh等[13]让12家医院的镜检专家对349份确诊的诺氏疟原虫感染样本进行镜检，91%的样本被诊断为三日疟原虫，剩余样本则被诊断为间日疟原虫和恶性疟原虫。故通过形态学检测很难确诊诺氏疟原虫感染。万孚和CareStartTM疟原虫快速检测试剂盒含有疟原虫乳酸脱氢酶(plasmodium lactate dehydrogenase, panLDH)抗体，为“泛疟疾抗体”，主要用于检测感染人类的4种常见疟原虫的抗原。诺氏疟原虫导致人类感染疟疾的重要性未引起足够的重视，目前所有商品化的疟原虫快速检测试剂盒均不能用于诺氏疟原虫的检测[14]，本研究中两种试剂盒的RDT结果均为阴性。

与镜检相比，分子生物学方法对疟原虫检测的敏感性和特异性更高[15-19]。本研究中，利用巢式PCR方法，通过诺氏疟原虫虫种特异性引物Pmk8和Pmkr9，从患者血样扩增出了预期的目的条带，序列分析进一步证实为诺氏疟原虫感染。

本研究充分分析了患者的流行病学史和临床表现，结合实验室检测结果，最终确诊为输入性诺氏疟原虫感染。目前，我国暂无针对诺氏疟原虫感染的抗疟药物使用规范，参考2015年世界卫生组织发布的《抗疟药物使用指南》(第三版)，结合我国《抗疟药物使用规范》(WS/T 485-2016)的用药标准，对患者进行磷酸氯喹和磷酸伯氨喹8 d疗法，服药后1周再口服双氢青蒿素磷酸哌喹片，患者痊愈。我国广东输入性诺氏疟原虫感染病例同样采用了该方案治疗[12]。此外，东南亚等国家和地区采用类似的治疗方法也治愈了许多诺氏疟原虫感染患者[20]。本研究再次证实以青蒿素为基础的联合治疗方法对治疗诺氏疟原虫感染是安全、有效、可行的。

人类自然感染诺氏疟原虫输入病例对我国疟疾防治工作提出了新的挑战，需要及时更新针对诺氏疟原虫感染的诊断、治疗和防控等相关知识，同时提高临床医生和疟疾防治专业人员对诺氏疟原虫感染的认识和诊治水平，为我国2020年实现消除疟疾的目标提供保障。