漆树黄酮逆转人肝癌细胞HepG2上皮间质转化的实验研究

李 蓉，黎小兵，敬 敏，陈 锦，黄培春

漆树黄酮(Fisetin)，3，3′，4′，7-四羟基黄酮是广泛存在于水果和蔬菜中的一种多酚化合物，具有抗氧化［1］、抗炎［2］等作用。抗肿瘤作用也是其重要药理作用之一，越来越多的细胞实验和动物实验显示漆树黄酮有抑制前列腺癌PC3和LNCaP细胞［3-4］、胰腺癌 AsPC-1 细胞［5］、肺癌 A549 细胞［6］、结肠癌HT-29细胞［7］的增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭以及化疗、放疗增敏的作用。我们前期的实验已证实漆树黄酮具有抑制人肝癌细胞HepG2增殖、诱导凋亡及增强化疗药物敏感性的作用。本文用体外实验的方法研究漆树黄酮对人肝癌细胞HepG2侵袭、运动能力和上皮标志物上皮性钙粘附蛋白(E-cadherin)、间质标志物波形蛋白(vimentin)、p38MAPK的影响，探讨漆树黄酮逆转的上皮间质转化及机制，分析其抗肿瘤侵袭运动的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肝癌细胞株HepG2由广东省天然药物研究与开发重点实验室中心提供。细胞在含10%小牛血清、青霉素1×105U·L-1、链霉素100 mg·L-1的 RPMI 1640 完全培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱培养。

1.2 药品与试剂 超级小牛血清购自杭州四季青公司;RPMI 1640培养基购自Gibco产品;纤维粘连蛋白(FN)及重组Matrigel购自BD公司;Transwell小室(直径6.5 mm，孔径8.0 μm)购自Sigma公司;漆树黄酮购自Sigma公司，实验前漆树黄酮用DMSO溶解，培养液稀释DMSO，终浓度≤0.1%，该浓度对细胞无影响。RT-PCR试剂盒(宝生物工程有限公司);PCR引物(由上海生工合成);兔抗人p38MAPK多克隆抗体、鼠抗人E-cadherin购自北京中杉金桥公司，鼠抗人vimentin购自北京博奥森公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 MTT法测定HepG2细胞增殖抑制作用 选取HepG2细胞配制成8×103/孔，接种到96孔中，常规培养。待细胞贴壁后，加入漆树黄酮，使其终浓度分别为 0(对照组)、50、100、200 μmol·L-1，设 4个复孔。继续培养24 h，加入MTT 20 μl(5 g·L-1)4 h。弃上清液，加入200 μl DMSO，震荡溶解。酶标仪测A570。增殖抑制率(IR/%)=［(对照组A570-实验组A570)/对照组A570］×100%。同时相差显微镜观察各浓度组HepG2细胞形态。

1.4 重组基底膜侵袭、趋化性运动实验 在Transwell小室膜的内表面涂基膜成分Matrigel 10 μg(50 μl)，超净台通风过夜使之干燥，形成人工重组基膜;在24孔培养板孔中加人含有10 mg·L-1纤维黏连蛋白的RPMI 1640培养基600 μl。收集对数生长期的细胞HepG2细胞，分别用加不同浓度漆树黄酮(同“1.3”)和未加漆树黄酮的含1%BSA的RPMI 1640培养基重悬并调整浓度为1×109·L-1。将Transwell小室浸于24孔板的条件培养基中，每个小室加细胞悬液100 μl，置孵箱内培养24 h将Transwell小室取出，滤膜用甲醇固定，结晶紫染色，棉签小心擦去未穿膜的细胞，干燥后中性树胶封片，于400倍显微镜下计数穿过滤膜的细胞数。每膜计数上下左右中5个随机不同视野。每组平行设3个滤膜。按照如下公式计算侵袭抑制率。侵袭抑制率(IR/%)=［(对照组穿膜细胞数-实验组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数］×100%。

运动实验与侵袭实验相比，只是PVPF滤膜上不需铺Matrigel。运动抑制率(IR/%)=［(对照组穿膜细胞数-实验组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数］×100%。

1.5 RT-PCR检测p38MAPK、E-cadherin和 vimentin mRNA表达 加入漆树黄酮后HepG2各组(分组方法同“1.3”)细胞继续培养24 h后，用TRIzol等试剂提取细胞的总RNA。核酸蛋白定量仪测定RNA的含量和纯度，取A260/A280＞1.8的样品用于RT-PCR实验。应用Primer Premier5.0软件和Web Primer 3软件进行引物设计。p38MAPK上游引物序列 5′-GGGGCACATCTGAACAACAT-3′，下游引物 5′-GCAAAGTAGGCATGTGCAAG-3′，扩增产物大小为599 bp。E-cadherin上游引物序列5′-AGT GAC GAA TGT GGT ACC TTT TGA-3′，下游引物 5′-TGAAGGGAGATGTTTGGGGAGGAAGGTC-3′，扩 增产物大小为507 bp。vimentin上游引物序列5′-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3′，下 游 引 物 5′-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3′，扩增产物大小为 750 bp，GAPDH 上游引物序列 5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′， 下 游 引 物 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′，扩增产物为231 bp。扩增条件50℃30 min，94℃ 3 min，94℃ 45 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共31个循环，最后72℃延伸7 min。取扩增产物5 μl用2.0%琼脂糖凝胶(内含EB染料)电泳。紫外灯下观察并用凝胶成像系统进行拍照。

1.6 Western blot检测 p38MAPK、E-cadherin、vimentin的表达 细胞分组同“1.3”，取1×106个细胞以细胞裂解液裂解，沸水变性5 min，15 000 r·min-14℃离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，取100 μg蛋白样品进行10%SDS-PAGE电泳。湿法电转移至PVDF膜，膜与兔抗人p38MAPK、鼠抗人E-cadherin及鼠抗人vimentin(1∶400)4℃孵育过夜，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG室温孵育2 h，ECL检测，β-actin作为内参照。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件的均数比较及单因素方差分析。

2 结果

2.1 漆树黄酮对HepG2细胞增殖抑制作用和形态学变化 漆树黄酮作用HepG2细胞24 h后的抑制率分别为(19.52±5.07)%、(27.54±4.11)%、(35.33 ±3.62)%(P ＜0.01)，IC50为244.52 μmol·L-1，在低于 250 μmol·L-1浓度下无明显的细胞毒作用，故选择的 50、100、200 μmol·L-1漆树黄酮作为体外侵袭、运动的实验浓度。不同浓度漆树黄酮(50、100、200 μmol·L-1)处理 24 h 后细胞的形态发生明显改变(Fig 1):空白对照组细胞呈梭形生长，细胞数增多。50 μmol·L-1组细胞连接较为松散，很多脱落变圆细胞，分散，少有连成一片，类成纤维样细胞数量减少;随着漆树黄酮浓度增高细胞的抑制作用明显，细胞变圆，黏附性降低，漂浮于培养液中。

Fig 1 the morphologic changes in HepG2 cells treated by fisetin(400×)A:Control group;B:50 μmol· L-1fisetin group;C:100 μmol·L-1fisetin group;D:200 μmol·L-1fisetin group

2.2 漆树黄酮对HepG2细胞侵袭基底膜成分能力的影响 用50、100、200 μmol·L-1的漆树黄酮处理细胞HepG2 24 h后，细胞侵袭基底膜成分能力明显降低，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，其抑制率分别是39.76%、51.17%、56.80%。见Fig 2。

2.3 漆树黄酮对HepG2细胞体外趋化运动能力的影响 用50、100、200 μmol·L-1的漆树黄酮处理细胞HepG2 24 h后，细胞体外趋化运动能力明显降低，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，其抑制率分别是 35.57%、44.10%、46.86%。见Fig 3。

2.4 漆树黄酮对p38MAPK、E-cadherin和vimentin mRNA表达影响 如Fig 4所示，当漆树黄酮作用浓度增大时，HepG2细胞各组p38MAPK mRNA表达扩增条带减弱，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);vimentin RNA表达扩增条带减弱，其中当漆树黄酮的浓度为100 μmol·L-1，vimentin mRNA表达明显减弱，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);E-cadherin mRNA表达扩增条带没有表达。

Fig 2 The effect of invasion in HepG2 cells treated by fisetin(400×)A:Control group;B:50 μmol· L-1fisetin group;C:100 μmol·L-1fisetin group;D:200 μmol·L-1fisetin group

Fig 3 The effect of migration in HepG2 cells treated by fisetin(400×)A:Control group;B:50 μmol· L-1fisetin group;C:100 μmol·L-1fisetin group;D:200 μmol·L-1fisetin group

2.5 漆树黄酮对p38MAPK、E-cadherin和vimentin蛋白表达影响 如Fig 5所示，当漆树黄酮作用浓度增大时HepG2细胞各组p38MAPK蛋白表达减弱，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);vimentin蛋白表达减弱，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);E-cadherin蛋白没有表达。

3 讨论

Fig 4 The mRNA expression of E-cadherin，vimentin and p38MAPK in HepG2 cells treated by fisetin1:Control group;2:50 μmol·L-1fisetin group;3:100 μmol·L-1fisetin group;4:200 μmol·L-1fisetin group

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞获得了成纤维细胞样表型，表现为上皮细胞标志物(E-cadherin/catenins复合体等)表达下调、伴随间叶细胞标志物(N-cadherin，vimentin，fibronectin等)出现、原有的细胞外基质降解、形成新的细胞-基质黏附等，其结果是细胞间黏附减弱、细胞运动能力大大增强。上皮-间叶样表型转化是胚胎发育过程中的生理现象，但近年来发现部分上皮细胞来源的恶性肿瘤发生发展过程中会出现“返祖现象”，与肿瘤细胞的浸润和远处转移密切相关［8-9］。本实验结果显示人肝癌细胞系HepG2细胞上皮间质标志物E-cadherin表达缺失，vimentin表达阳性，HepG2细胞呈梭形。HepG2细胞发生EMT;HepG2细胞能降解基底膜，具有转移侵袭能力。如果用漆树黄酮针对这一环节进行药物干预，观察漆树黄酮能否能通过逆转EMT，从而降低转移侵袭潜能，为开发漆树黄酮的药理作用奠定一定的基础。本研究发现，漆树黄酮抑制分子间质标志物vimentin表达，上皮标志物 E-cadherin表达没有增强。形态学方面表现为用药后HepG2细胞连接较为松散，很多细胞脱落变圆，分散、少有连成一片，类成纤维样细胞数量减少，同时运动侵袭试验显示漆树黄酮能降低HepG2细胞侵袭和运动能力。说明漆树黄酮能引起能逆转HepG2细胞EMT，降低HepG2细胞转移潜能。

Fig 5 The protein expression of E-cadherin，vimentin and p38MAPK in HepG2 cells treated by fisetin1:Control group;2:50 μmol·L-1fisetin group;3:100 μmol·L-1 fisetin group;4:200 μmol·L-1fisetin group

p38MAPK自1993年被Brewster等首先发现以来逐步成为生物学研究的热点。研究发现［10］p38MAPK是原肠胚形成过程中E-cadherin的负调控因子。表明p38MAPK也是一重要的EMT的重要转录因子，在胚胎发育的某些过程中，肩负着引发细胞移动以及组织重组的任务。而类似的细胞移动以及组织重塑情形在肿瘤转移的时候也会发生。实验发现漆树黄酮抑制p38MAPK并没有提高E-cadherin的表达，而是抑制vimentin表达，来逆转HepG2细胞EMT，降低HepG2细胞转移潜能。p38MAPK逆转EMT的机制有待进一步深入研究。

［1］Hanneken A，Lin F F，Johnson J.et al.Flavonoids protect human retinal pigment epithelial cells from oxidative-stress-induced death［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(7):3164-77.

［2］Higa S，Hirano T，Kotani M，et al.Fisetin，a flavonol，inhibits TH2-type cytokine production by activated human basophils［J］.J Allergy Clin Immunol，2003，111(6):1299-306.

［3］Khan N，Afaq F，Syed D N，et al.Fisetin，a novel dietary flavonoid，causes apoptosis and cell cycle arrest in human prostate cancer LNCaP cells［J］.Carcinogenesis，2008，29(5):1049-56.

［4］Haddad A Q，Fleshner N，Nelson C，et al.Antiproliferative mechanisms of the flavonoids 2，2′-dihydroxychalcone and fisetin in human prostate cancer cells［J］.Nutr Cancer，2010，62(5):668-81.

［5］Murtaza I，Adhami V M，Hafeez BB，et al.Fisetin，a natural flavonoid，targets chemoresistant human pancreatic cancer AsPC-1 cells through DR3-mediated inhibition of NF-κB［J］.Int J Cancer，2009，125(10):2465-73.

［6］Liao Y C，Shih Y W，Chao C H，et al.Involvement of the ERK signaling pathway in fisetin reduces invasion and migration in the human lung cancer cell line A549［J］.J Agric Food Chem，2009，57(19):8933-41

［7］Chen W S，Lee Y J，Yu Y C，et al.Enhancement of p53-mutant human colorectal cancer cells radiosensitivity by flavonoid fisetin［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2010，77(5):1527-35.

［8］Geiger T R，Peeper D S.Metastasis mechanisms［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1796(2):293-308.

［9］徐思云，李 静，耿美玉.上皮间质转化的信号转导调控及药物开发［J］.中国药理学通报，2008，24(9):1131-4.

［9］Xu S Y，Li J，Geng M Y.The signal transduction and drug development of epithelial-mesenchymal transition［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(9):1131-4.

［10］Zohn I E，Li Y，Skolnik E Y，et al.p38 and a p38-interacting protein are critical for downregulation of E-cadherin during mouse gastrulation［J］.Cell，2006，125(5):957-69.