2-甲氧基雌二醇对CEM细胞增殖的影响及其机制研究

张学亚，潘敬新，郭熙哲，战 榕

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME2)是17β-雌二醇在体内的生理代谢产物，由雌二醇2位碳原子先羟基化再甲基化而来，化学名为17β-2-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇［1］。具有选择性杀伤肿瘤细胞［2］，而对正常细胞毒性小［3］以及对雌激素受体α和β无依赖性［4］等特点，受到人们的广泛关注。有研究表明［2］2-ME2在体外能够抑制多种不同组织来源的肿瘤细胞增殖，体内动物模型试验亦表明2-ME2具有明显的抑制肿瘤增殖及减少肿瘤负荷的作用。但其确切作用机制尚不明确。本文选择人急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM作为2-ME2体外研究模型，探讨其对CEM细胞的抗肿瘤作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂:人急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM细胞(福建省血液病研究所细胞库);2-ME2购自Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)溶解配成2 mmol·L-1原液，4℃保存备用，实验前用细胞培养液稀释，DMSO终浓度＜0.1%。标准胎牛血清为杭州四季青公司产品，RPMI 1640为Gibco公司产品，Akt、p-Akt(ser473)兔多抗购自Cell Signaling Technology公司，β-actin鼠单抗为武汉博士德公司产品，蛋白酶抑制剂为上海康成生物工程有限公司产品，化学发光底物试剂和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠、羊抗兔抗体均购自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 人急性淋巴细胞白血病CEM细胞株的培养常规复苏人急性淋巴细胞白血病CEM细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下进行培养，2～3 d换液传代1次。所有实验均采用对数生长期细胞。

1.2.2 MTT法检测2-ME2对CEM细胞增殖活性的影响 将CEM细胞(1×108·L-1)接种于96孔培养板中，经不同浓度的2-ME2作用48 h，实验结束前4 h加入MTT(Amresco公司)，继续培养4 h，加入二甲基亚砜，振荡10 min充分溶解结晶，置酶标仪(美国Stat公司，Fax-2100型)上用492 nm和630 nm双波长测吸光度值(A值)。细胞增殖抑制率/%=(1-用药组平均A值/对照组平均A值)×100%［6］。

1.2.3 RT-PCR法检测2-ME2对CEM细胞VEGF和hTERT mRNA表达的影响 收集2 μmol·L-12-ME2作用不同时间后的待测细胞，1/15 mmol·L-1PBS洗涤后，用TRIzol试剂(Invitrogen公司产品)提取各组细胞总RNA，操作按产品说明书进行。紫外分光光度计分析及琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的含量、纯度及完整性。cDNA第1链的合成按反转录试剂盒(Promega公司产品)说明书进行。以βactin为内参照，经凝胶图像分析仪(Gel Doc 1000型，美国Bio-Rad公司产品)对PCR结果进行半定量分析。所用引物序列应用oligo软件自行设计，由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列如下:VEGF:上游引物序列，5′-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3′;下游引物序列，5′-CGATCGTTCTGTATCGTCTTTCC-3′，产物长度为 541 bp，退火温度，64℃;hTERT:上游引物序列，5′-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3′，下游引物序列，5′-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3′，产物长度为 145 bp，退火温度，60℃;β-actin:上游引物序列，5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′，下游引物序列，5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′，产物长度为887 bp，退火温度，56℃。PCR扩增的有关参数如下:94℃变性5 min后进入下列循环:94℃变性30 s，最佳退火温度40 s，72℃延伸共32个循环后，72℃延伸7 min。制备含核酸燃料的1.5%琼脂糖凝胶，取5 μl反应产物加适量溴酚蓝点样电泳10 min，经凝胶图像分析仪(Gel Doc 1000型，Bio-Rad)拍照并进行半定量分析，以目的基因电泳条带的荧光强度值与β-actin电泳条带荧光强度值的比值表示相对表达水平［6］。

1.2.4 Western blot法检测2-ME2对CEM细胞Akt和p-Akt蛋白表达的影响 收集2 μmol·L-12-ME2作用不同时间后的待测细胞，预冷的PBS洗涤两遍后，加入 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Pierce公司)细胞裂解液提取细胞总蛋白，充分裂解后，低温离心机12 000 r·min-1离心10 min，BCA 法(Pierce公司)定量蛋白浓度，取20 μg蛋白，加入上样缓冲液，99℃变性5 min，10% ～15%的SDS-PAGE凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜(GE公司)上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜后加相应二抗室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min，用化学发光底物试剂(Pierce公司)检测分析［6］。

1.3 统计学分析 采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行单因素方差分析。组间分析采用t检验。

2 结果

2.1 2-ME2对CEM细胞增殖的影响 不同浓度2-ME2明显抑制CEM细胞的增殖，随着作用浓度增加，细胞增殖的抑制率逐渐增高，抑制率50%时浓度为 2 μmol·L-1(Fig 1)。

2.2 2-ME2对 CEM 细胞 VEGF和 hTERT mRNA表达的影响 RT-PCR结果可见，2 μmol·L-1作用CEM细胞24 h后，hTERT mRNA表达水平即有减弱，并随作用时间延长趋势越明显，同时，VEGF mRNA表达水平随作用时间延长而逐渐减弱，作用72 h，已几乎检测不到VEGF mRNA的表达。实验组与对照组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05，Fig 2)。

Fig 1 Effect of 2-ME2 on CEM cell proliferation at different concentrations at 48 h

Fig 2 Variation of hTERT，VEGF gene mRNA in CEM cells after treatment with 2 μmol·L －12-ME2*P＜0.05 vs control

2.3 2-ME2对CEM细胞 Akt、p-Akt蛋白表达的影响 2-ME2处理CEM细胞24 h后，p-Akt蛋白表达水平急剧下降，作用48 h后达到最低。而总Akt蛋白表达水平则无变化。实验组与对照组相比，差异均具有统计学意义(P＜0.05，Fig 3)。

3 讨论

白血病是一组异质性的造血系统恶性肿瘤，造血干/祖细胞在分化过程的不同阶段发生恶性增殖是其重要致癌机制之一。其中端粒酶活性增强及异常活跃的肿瘤血管新生可导致白血病细胞增殖失控，进而诱发白血病发生。因此，抑制白血病细胞端粒酶活性和血管新生已成为造血系统恶性肿瘤治疗的新策略［7-8］。其中，hTERT是维持端粒酶活性最重要的成分，hTERT与端粒酶活性呈平行相关，hTERT活性表达被认为是端粒酶激活的限速步骤［9-10］。章尧等［11］研究报道三氧化二砷体外能够有效抑制HL-60增殖，这与下调hTERT mRNA表达相关。我们的研究发现不同浓度2-ME2能够抑制白血病细胞株CEM的增殖，呈现剂量依赖关系，其半数抑制浓度(IC50)为2 μmol·L-1。RT-PCR 实验研究结果显示，2-ME2抑制CEM细胞增殖的过程中，hTERT mRNA表达水平随着细胞增殖抑制程度的升高而逐渐下降。提示下调hTERT mRNA表达参与了2-ME2抑制CEM细胞增殖的过程。

Fig 3 Variation of Akt，p-Akt in CEM cells after treatment with 2 μmol·L －12-ME2*P＜0.05 vs control

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前活性最强的血管生长因子，VEGF不仅对实体瘤的发生发展产生明显影响，而且在多数造血系统恶性肿瘤中也起重要作用［12］，VEGF在白血病发生中的作用还不够明确，很可能VEGF通过结合其相应的受体，进一步使Akt磷酸化促进PI3K/Akt信号通路的转导，进而促进癌细胞的生存与增殖［11］。Akt是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，Akt信号通路是细胞内重要信号转导通路之一，它与人类多种肿瘤的发生发展关系密切，有资料显示［13-14］在很多肿瘤的发生发展过程中Akt活性增高，是抗肿瘤药物治疗的有效作用靶点。因此，通过抑制VEGF的表达而干扰PI3K/Akt信号通路的转导，成为一种新的药物抗肿瘤机制。我们的结果显示2-ME2作用CEM细胞24 h后，VEGF mRNA表达即有明显降低，并呈现时间依赖性，同时，p-Akt的表达24 h呈现急剧下降趋势，48 h达到最高抑制效应，而总Akt蛋白表达水平则无变化。这表明2-ME2可以通过抑制VEGF表达而阻断Akt信号通路转导从而达到抑制CEM细胞增殖的作用。由于Akt信号通路网络错综复杂，2-ME2干扰该通路转导是否还存在其他因素，还有待于进一步研究。

总之，我们研究发现2-ME2体外能够有效抑制CEM细胞增殖，降低hTERT mRNA表达和部分通过降低VEGF mRNA表达而阻断PI3K/Akt信号通路可能是其作用机制。

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