褪黑素对HeLa细胞的生长及NF-κB蛋白表达的影响

陈少雅，陈崇宏，杨丽娟，林 菁

褪黑素(melatonin，MT)是生物体内普遍存在的一种吲哚类激素，在人体内主要由松果体合成和分泌。大量研究表明，MT具有镇痛、镇静、调整时差、抗氧化、免疫增强、抗肿瘤［1］等作用，且相对安全。在抗肿瘤及肿瘤辅助治疗方面存在理论价值和应用前景。目前，中、晚期宫颈癌位居十大高死亡率恶性肿瘤之列。宫颈癌术后必须进行化疗，有临床研究表明［2］宫颈癌患者血浆中MT水平较正常人低，故MT用于宫颈癌治疗具备可能性。然而，国外已有的MT对HeLa细胞抑制作用的研究结果存在争议［3］。MT抗肿瘤的机制目前仍不清楚。NF-κB在HeLa细胞中高表达，对肿瘤的发生、发展发挥重要作用，是肿瘤预防和治疗的潜在靶点［4］。因此，本研究旨在对MT抗HeLa细胞增殖活性作进一步探讨，并探究其与NF-κB蛋白表达的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人宫颈癌HeLa细胞购于上海中国科学院细胞库。

1.1.2 药品及试剂 MT，Sigma公司产品;RPMI 1640培养基干粉，Hyclone产品;胰蛋白酶为Difco进口分装;小牛血清，杭州四季青生物试剂公司产品;碘化丙啶(PI)，吖啶橙(AO)，溴化乙锭(EB)，四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品;其余试剂均为分析纯产品;anti-NF-κB小鼠单抗;anti-β-actin山羊单抗;辣根酶标记兔抗山羊IgG、碱磷酶标记马抗小鼠IgG、碱磷酶标记山羊抗兔IgG，均为Santa Cruz产品;碱性磷酸酶(AP)显色底物为进口分装。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞体外增殖抑制试验 取对数生长期的HeLa细胞，以0.25%胰蛋白酶充分消化后，以培养基配成适当浓度接种于96孔培养板中，180 μl/孔，实验组加入等体积不同浓度的药物20 μl/孔(终浓度分别为 0.008、0.04、0.2 及 1 g·L-1)，对照组加入等体积培养液。每组设4个复孔。在药液分别作用1～5 d后，每天取1块培养板，加入5 g·L-1MTT 20 μl/孔终止药物作用，在培养箱中继续孵育4 h后，弃净上清液，加DMSO 150 μl/孔，空白对照孔只加入 DMSO 150 μl/孔，振荡10 min，492 nm波长下用酶标仪测定光吸收值(OD492)。直线回归法计算IC50。

1.2.2 AO和EB双染荧光显微镜观察MT对HeLa细胞形态学的影响 取对数生长期HeLa细胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，离心，全培养基稀释成5×107·L-1接种于6孔培养板，待细胞贴壁后加入MT使每孔细胞终浓度为200 mg·L-1，对照组加入等体积含10 ml·L-1无水乙醇的培养液，分别孵育1、2及3 d后，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，离心收集细胞，用PBS洗涤两次后，稀释成1010·L-1细胞悬液，取10 μl细胞悬液与1 μl AO 和1 μl EB 混合(AO、EB终浓度均为4 mg·L-1)，滴于载玻片上，用荧光显微镜观察并拍照。

1.2.3 Western blot法检测NF-κB蛋白水平 取对数生长期的HeLa细胞分别以全培养基及含MT(终浓度为0.008、0.04、0.2 g·L-1)培养基孵育 1、2 及3 d，收集不同时间点的细胞，用去污裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白，用考马斯亮蓝法测各组蛋白浓度，制备100 g·L-1SDS-PAGE，每泳道加总蛋白90 μg，进行电泳，转膜，丽春红-S 染色，50 g·L-1BSATBST常温下封闭过夜后，分别加入anti-NF-κB小鼠单抗(一抗)、anti-β-actin山羊单抗反应2 h，PBS漂洗2次，TBST漂洗1次，分别加入碱磷酶标记马抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶标记兔抗山羊IgG反应1 h，TBST漂洗3次，分别用AP、DAB显色底物(避光反应)，NC膜上显色至出现清晰的条带，立即终止显色，洗膜，晾干，拍照，膜永久保存。用 Gel-Pro Analyzer分析软件分析通道蛋白的灰度，相对含量用 NF-κB/β-actin灰度值比表示。

2 结果

2.1 MT对HeLa细胞的抗增殖活性 HeLa细胞的生长曲线显示，随着MT剂量的增加，作用时间的延长，抑制增殖作用明显增强，生长曲线随之下移。MT作用3 d，抑制 HeLa细胞的 IC50为61.71 mg·L-1(Fig 1)。

2.2 AO和EB双染荧光显微镜观察MT对HeLa细胞形态学的影响 荧光显微镜下，对照组经胰酶消化的HeLa细胞呈圆形(Fig 2A);MT 1 g·L-1作用1、2、3 d组，胞膜溶解的坏死细胞随作用时间的延长而逐渐增多，凋亡细胞少见(Fig 2B、C、D)。由此可见，MT主要致HeLa细胞坏死而少致凋亡。

2.3 MT对HeLa细胞NF-κB蛋白水平的影响MT 0.2 g·L-1作用 1、2、3 d，对 HeLa 细胞 NF-κB蛋白水平的抑制作用呈明显的时间依赖性。作用时间越长，抑制作用越明显。MT 0.2 g·L-1作用1、2、3 d NF-κB蛋白水平明显抑制，与对照组比较，P＜0.01;MT 0.2 g·L-1作用2及3 d较作用1 d的NF-κB蛋白水平低，MT 0.2 g·L-1作用3 d较作用2 d的 NF-κB 蛋白水平低，P ＜0.01(Fig 3)。

MT 0.008、0.04 及 0.2 g·L-1作用 3 d，对 He-La细胞NF-κB蛋白水平的抑制作用呈明显的浓度依赖性。MT 0.008、0.04及0.2 g·L-1作用3 d对NF-κB蛋白水平的抑制作用明显，与对照组比较，P＜0.01;MT 0.04 及0.2 g·L-1较 MT 0.008 g·L-1组对NF-κB蛋白水平的抑制作用明显，P＜0.01;MT 0.2 g·L-1较 MT 0.04 g·L-1对 NF-κB 蛋白水平的抑制作用明显，P＜0.01(Fig 4)。

Fig 1 Inhibiting activity of melatonin on HeLa cells by MTT assay( ± s，n=5)MT1:Treated with MT 8 mg·L-1;MT2:With 40 mg·L-1;MT3:With 200 mg·L-1;MT4:With 1 g·L-1

Fig 2 Morphological alterations of HeLa cells stained with AO/EB by fluorescene staining(×400)A:Control;B:Treated with melatonin 1 g·L-1for 1 d;C:for 2 d and D for 3 d.→，necrosis cells

3 讨论

MT作为几无毒性的内源性激素，其抗肿瘤活性及应用前景已引起广泛关注。国内外报道［5-7］多显示MT对体内、外肿瘤有抑制增殖作用。在多种体外培养肿瘤细胞株上，多家实验室均观察到MT可抑制肿瘤细胞的增殖，但有关抗肿瘤活性的有效剂量报道不一［3］，可能与体外培养肿瘤细胞系的类别、给药时间、药物的溶解度等实验条件不同有关。本课题组前期工作显示MT对体外培养HeLa细胞系有抑制增殖作用，且主要表现为细胞坏死，坏死程度呈剂量依赖性，未见明显的细胞凋亡。由此可见，MT抑制HeLa细胞增殖是导致细胞坏死为主而非促发细胞凋亡。

Fig 3 The influences of melatonin on NF-κB levels on HeLa cells by Western blot analysis(±s，n=5)Group 1，treated with MT 0.2 g·L-1for 1 d;Group 2 for 2 d;Group 3 for 3 d.NF-κB/Relative densities，＊＊P ＜0.01 vs control;△△P＜0.01 vs group 1;○○P ＜0.01 vs group 2

Fig 4 The influences of melatonin on NF-κB levels on HeLa cells by Western blot analysis(±s，n=5)MT1:Treated with MT 0.008 g·L-1;MT2:With 0.04 g·L-1;MT3:With 0.2 g·L-1.NF-κB/Relative densities，＊＊P ＜ 0.01 vs control，△△P ＜0.01 vs MT1，○○P ＜0.01 vs MT2

MT的抗肿瘤作用机制广泛而复杂［8-10］，目前主要的观点包括抗氧化作用、免疫调节作用、对细胞代谢及细胞周期的影响，调节生长因子，干扰钙调素和微管蛋白的功能，作用于MT1受体调节多种基因表达等。有报道表明，MT通过抑制NF-κB活性而增强TNF-α所致的肿瘤细胞死亡［11］;皮质酮抑制NF-κB来调制NA诱导的MT合成［12］。MT对HeLa细胞中高表达的NF-κB是否有影响未见相关报道。

NF-κB是广泛存在于人体组织细胞中的转录因子，最常见的家族成员是p65/p50异源二聚体，对众多基因发挥转录调节作用。NF-κB通常在胞质中与抑制蛋白 IκB 结合呈非活性状态，IκB-α 对 NF-κB的活化起主要调控作用，NF-κB的活化主要依赖于IκB蛋白的磷酸化，而 IκB 蛋白的磷酸化在 IκB 激酶(主要为IκKβ)催化下进行。激活的NF-κB移位入胞核后可上调多种靶基因的表达，包括多种细胞因子的表达，与肿瘤的发生和发展［13］等密切相关。NF-κB在许多疾病发病机制中扮演关键角色［14-15］。有报道显示［16］，NF-κB增高可促进肿瘤的增殖与转移，并且导致肿瘤化疗耐药。NF-κB抑制剂已成为目前治疗肿瘤的新策略。

鉴于MT和NF-κB作用及机制的复杂性、关联性，为探究MT抑制HeLa细胞与NF-κB水平的关系，本研究采用Western blot法检测不同浓度的MT对HeLa细胞 NF-κB的蛋白水平的影响。结果提示，MT 0.2 g·L-1作用 1、2 及 3 d，对 HeLa 细胞生长抑制的同时NF-κB蛋白水平下调，从MT作用2 d开始，呈时间依赖性。MT 0.008、0.04及0.2 g·L-1作用3 d，对HeLa细胞 NF-κB蛋白水平的下调呈明显的浓度依赖性。说明MT对HeLa细胞的抗增殖活性与NF-κB蛋白水平的下调可能有关。与文献报道［15］相符。NF-κB与细胞因子的关系复杂，细胞因子TNF-α可导致细胞凋亡和坏死，HeLa细胞的坏死可能与MT抑制NF-κB而增强TNF-α功能有关［11］，也可能是MT抗肿瘤的复杂机制共同导致。

综上所述，MT抑制HeLa细胞增殖的机制复杂，下调 NF-κB水平可能与其抗肿瘤机制有关。NF-κB与其信号转导通路上各个抑制环节的关系如何?MT造成HeLa细胞坏死与NF-κB下调影响细胞因子的作用是否关联?有待下一步实验验证，为开发MT及其类似物和NF-κB抑制剂用于肿瘤化疗及化疗增敏方面提供理论基础。

［1］Taies M，Gutierrez-Cuesta J，Ortuño-Sahagun D，et al.Anti-aging properties of melatonin in an in vitro murine senescence model:involvement of the sirtuin 1 pathway［J］.J Pineal Res，2009，47(3):228-37.

［2］Karasek M，Kowalski A J，Suzin J，et al.Serum melatonin circadian profiles in women suffering from cervical cancer［J］.J Pineal Res，2005，39(1):73-6.

［3］Panzer A，Lottering M L，Bianchi P，et al.Melatonin has no effect on the growth，morphology or cell cycle of human breast cancer(MCF-7)，cervical cancer(HeLa)，osteosarcoma(MG-63)or lymphoblastoid(TK6)cells［J］.Cancer Lett，1998，122(1-2):17-23.

［4］Van Waes C.Nuclear factor-kappaB in development，prevention，and therapy of cancer［J］.Clin Cancer Res，2007，13(4):1076-82.

［5］Dong C，Yuan L，Dai J，et al.Melatonin inhibits mitogenics crosstalk between retinoic acid-related orphan receptor alpha(RORalpha)and Eralpha in MCF-7 human breast cancer cells［J］.Steroids，2010，75(12):944-51.

［6］Romero A，Egea J，García A G，López M G.Synergistic neuroprotective effect of combined low concentrations of galantamine and melatonin against oxidative stress in SH-SY5Y neuroblastoma cells［J］.J Pineal Res，2010，49(2):141-8.

［7］Cabrera J，Negrin G，Estévez F，et al.Melatonin decreases cell proliferation and induces melanogenesis in human melanoma SKMEL-1 cells［J］.J Pineal Res，2010，49(1):45-54.

［8］Mazzoccoli G，Vendemiale G，De Cata A，et al.Altered time structure of neuro-endocrine-immune system function in lung cancer patients［J］.BMC Cancer，2010，10:314.

［9］Hill S M，Frasch T，Xiang S，et al.Molecular mechanisms of melatonin anticancer effects［J］.Integr Cancer Ther，2009，8(4):337-46.

［10］胡世莲.褪黑素抗肿瘤作用及其机制的研究进展［J］.中国药理学通报，2008，24(4):428-31.

［10］Hu S L.Melatonin in the treatment of cancer and its mechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(4):428-31.

［11］Sainz R M，Reiter R J，Tan D X，et al.Critical role of glutathione in melatonin enhancement of tumor necrosis factor and ionizing radiation-induced apoptosis in prostate cancer cells in vitro［J］.J Pineal Res，2008，45(3):258-70.

［12］Ferreira Z S，Fernandes P A，Duma D，et al.Corticosterone modulates noradrenaline-induced melatonin synthesis through inhibition of nuclear factor kappa B［J］.J Pineal Res，2005，38(3):182-8.

［13］Bernal-Mizrachi L，Lovly C M，Ratner L.The role of NF-［kappa］B-1 and NF-［kappa］B-2-mediated resistance to apoptosis in lymphomas［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(24):9220-5.

［14］O′Keeffe M，Grumont R J，Hochrein H，et al.Distinct roles for the NF-kappaB1 and c-Rel transcription factors in the differentiation and survival of plasmacytoid and conventional dendritic cells activated by TLR-9 signals［J］.Blood，2005，106(10):3457-64.

［15］Tripathi D N，Jena G B.Effect of melatonin on the expression of Nrf 2 and NF-kappa B during cyclophosphamide-induced urinary bladder injury in rat［J］.J Pineal Res，2010，48(4):324-31.

［16］Katsman A，Umezawa K，Bonavida B.Chemosensitization and immunosensitization of resistant cancer cells to apoptosis and inhibition of metastasis by the specific NF-kappaB inhibitor DHMEQ［J］.Curr Pharm Des，2009，15(7):792-808.