青蒿琥酯抗大鼠免疫性肝纤维化的作用及机制研究

来丽娜，杨柳絮，郭春花，张晓一，王黎敏，范毅敏

肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。现普遍认为肝纤维化属可逆性病变，但目前仍没有疗效确切且不良反应少的抗肝纤维化药物。我国中药资源丰富，从天然药物中发掘抗肝纤维化的药物具有广阔的前景。

青蒿素是从黄花蒿中提取的一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物。青蒿素及其衍生物具有抗疟、免疫抑制、抗病毒及抗肿瘤等多方面药理作用，且不良反应较少［1］。青蒿琥酯(artesunate，Art)为青蒿素水溶性的衍生物。我们前期研究发现［2］，青蒿琥酯对CCl4混合因素所致的大鼠肝纤维化有防治作用，本实验制备免疫性大鼠肝纤维化模型，进一步探讨青蒿琥酯的抗肝纤维化作用及其可能机制，为其开发成抗肝纤维化药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与HSC-T6细胞株 Wistar大鼠，♀♂各半，清洁级，体质量175 ～200 g，购自山西医科大学实验动物中心。HSC-T6细胞株由长治医学院肝病研究所赵中夫教授惠赠。

1.1.2 实验药品和试剂 青蒿琥酯，广西桂林制药二厂;秋水仙碱(colchicine，Col)，昆明股份制药有限公司，批号070509;不完全弗氏佐剂，Sigma公司产品;牛血清白蛋白(Albumin Bovine，BSA)，Amresco公司产品分装;羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)，上海润成生物科技有限公司，分析纯，批号20090322。TGF-β1(Sigma公司)，RNAiso Plus抽提试剂(TaKa-Ra公司)，DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)，RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa公司)，Western细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)，HRP标记的anti-Mouse IgG(Promega公司)，小鼠来源GAPDH一抗(碧云天生物技术研究所)，小鼠来源collagenⅠ一抗(Abcam公司)，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及分组 将弗氏不完全佐剂与同体积的18 g·L-1BSA生理盐水溶液混合并顺时针研磨制成9 g·L-1BSA弗氏不完全佐剂乳剂。除正常组外。每只大鼠每次0.5 ml足垫注射，共5次。第1、2次间隔2周，其余间隔1周。末次致敏注射后1周，球后静脉丛采血测抗BSA抗体。取抗体阳性者尾静脉攻击注射5 g·L-1BSA生理盐水溶液(0.1 ml·kg-1)，每周2次，共10次。大鼠随机分为正常对照组、模型组、大、中、小剂量 Art组(5、15、45 mg·kg-1)、Col组(0.1 mg·kg-1)。治疗组自尾静脉攻击注射BSA生理盐水开始灌胃给药，模型组和正常对照组灌胃同剂量蒸馏水，每日1次，直至实验结束。实验结束后，股动脉放血制备血清，-20℃冰箱保存。同时留取肝脏组织用于各项检测。

1.2.2 肝组织病理学观察 取肝左叶相同部位，10%甲醛溶液固定，石蜡切片，Masson染色，光镜下观察胶原纤维增生情况。

1.2.3 肝组织Hyp的测定 肝组织脱脂，研磨烘干，衡重后取组织粉末40 mg装入定做的安瓿中，加入6 mol·L-1HCl 6 ml乙醇喷灯封口，105℃烤24 h，冷却后敲开安瓿，取50 μl放入试管中烘干待测，参照 Jamall的方法［3］。

1.2.4 RT-PCR 检测肝组织 α-SMA、TGF-β1mRNA的表达 RNAiso Plus提取肝组织总RNA，定量。以总RNA 1 μg为模板，用oligo(dT)作为引物。TGF-β1(547 bp)［4］:上游 5′-GCG GTG CTC GCT TTG T-3′，下游 5′-GGA AGG GTC GGT TCA T-3′;α-SMA(542 bp):上游 5′-CTG TCC CTC TAT GCC TGT GG-3′，下游 5′-AGG GCT GTG ATC TCC TTC TG-3′;βactin(300 bp):上游 5′-AGC TGA GAG GGA AAT CGT GCG-3′;下游 5′-GTG CCA CCA GAC AGC ACT GTG-3′。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统测定条带的灰度值，以目的条带与β-actin条带灰度值之比作为半定量标准。

1.2.5 HSC-T6细胞的培养和分组 采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，常规培养于37℃、5%CO2培养箱中。实验分为对照组，TGF-β1刺激组(5 μg·L-1)，联合处理组(Art终浓度［5］6.25、25、50 mg·L-1+5 μg·L-1TGF-β1)。细胞生长至 80%以上融合度时，全部换含无血清的DMEM培养液同步化处理12 h后吸弃培养液。TGF-β1组换含5 μg·L-1TGF-β1的培养液，联合处理组用 5 μg·L-1TGF-β1预处理 30 min 后［6］再加入不同浓度的 Art作用24 h。

1.2.6 RT-PCR检测HSC-T6细胞 ProcollagenⅠmRNA 的表达 ProcollagenⅠ(698bp)［7］:上游 5′-CCT GGC AAG AAC GGA GAT GAT-3′;下游 5′-ACC GAC AGC ACC ATC GTT ACC-3′。

1.2.7 Western blot检测HSC-T6细胞collagenⅠ蛋白的表达 裂解液裂解细胞，蛋白定量。取总蛋白50 μg，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上，封闭后分别加入一抗，4℃过夜，洗膜后再与辣根过氧化物酶偶联的二抗杂交，加入ECL发光液。X线底片曝光。以目的条带与内参照GAPDH条带灰度值的比值代表蛋白的表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS 11.5软件分析，实验数据以±s表示，均数间比较采用单因素方差分析，多组间比较用SNK法。

2 结果

2.1 Art对大鼠肝组织病理变化的影响 正常组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞呈索状分布，板间有不规则肝窦，汇管区无扩大。模型组正常小叶结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，胶原纤维构成的纤维间隔破坏界板，分割包绕肝小叶，有半数以上有假小叶形成。Art组大部分肝小叶结构接近正常，仅汇管区有少量纤维增生，肝索排列趋于整齐，少许尚留有较细的纤维条索但无小叶包绕。Col组肝细胞索排列紊乱，胶原纤维增生程度较模型组轻，有纤维条索分割包绕小叶，但未见明显的假小叶的形成，见Fig 1。

Fig 1 Effect of Art on the histological morphology of immunological hepatic fibrosis rat liver by Masson staining(×75)A:Normol group;B:Model group;C:Art treated group(5 mg·kg-1);D:Art treated group(15 mg·kg-1);E:Art treated group(45 mg·kg-1);F:Col treated group(0.1 mg·kg-1).

2.2 Art对大鼠肝组织Hyp的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝脏Hyp含量明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，Art各剂量组大鼠肝组织中Hyp的含量明显降低(P＜0.01)，与Col组比较差异无显著性，见Tab 1。

Tab 1 Effect of Art on content of hyproxyproline in immunological hepatic fibrosis rat liver( ± s，n=10)

Tab 1 Effect of Art on content of hyproxyproline in immunological hepatic fibrosis rat liver( ± s，n=10)

△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs normal group;＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 Hyp/mg·g-1liver Normol 0.511±0.184 Model 2.556±0.588△△Art 5 0.946±0.257＊＊15 0.725±0.297＊＊45 0.816±0.282＊＊Col 0.1 1.229±0.306△＊＊

2.3 Art对大鼠肝组织 α-SMA、TGF-β1mRNA 表达的影响 RT-PCR结果显示，模型组α-SMA and TGF-β1mRNA表达明显高于正常组(P＜0.01);Art 15、45 mg·kg-1治疗组 α-SMA mRNA表达明显低于模型组(P＜0.01)，Art 5 mg·kg-1组和Col组与模型组比较，α-SMA mRNA表达也降低(P＜0.05)，Art 15、45 mg·kg-1治疗组和 Col组 TGF-β1mRNA表达明显低于模型组(P＜0.01)，Art 5 mg·kg-1组与模型组比较，TGF-β1mRNA表达也降低(P＜0.05)，见 Fig 2。

Fig 2 Effect of Art on expression of α-SMA and TGF-β1 mRNA in immunological hepatic fibrosis rat liver¯±s，n=6)A:Expression of α-SMA mRNA was detected by RT-PCR;B:Expression of TGF-β1mRNA was detected by RT-PCR;C:The densitometric analysis for relative changes in the indicated groups.M:DNA marker;1:normol group;2:Model group;3:Art treated group(5 mg·kg-1);4:Art treated group(15 mg·kg-1);5:Art treated group(45 mg·kg-1);6:Col treated group(0.1 mg·kg-1).△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs normal group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

2.4 Art对 HSC-T6ProcollagenⅠmRNA 和 collagenⅠ蛋白表达的影响 从Fig 3中可以看到，TGF-β1组ProcollagenⅠmRNA和collagenⅠ蛋白表达明显高于对照组(P＜0.01)，与 Art共培养后，Art 6.25、25、50 mg·L-1ProcollagenⅠmRNA 和 collagenⅠ蛋白的表达明显降低(P＜0.01)，Art 50 mg·L-1尤为明显。

Fig 3 Effect of Art on expression of procollagenⅠmRNA and collagenⅠproteins in HSC-T6 cells(±s，n=6)A:Expression of procollagenⅠmRNA was detected by RT-PCR assay;B:Expression of collagenⅠprotein was detected by Western blot assay;C:The densitometric analysis for relative changes in the indicated groups.M:DNA marker;1:Control group;2:TGF-β1group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs TGF-β1group.

3 讨论

有报道青蒿素类化合物能治疗结缔组织增生性疾病，对CCl4引起的小鼠肝损伤有保护作用，以青蒿鳖甲汤为主方配合辨证用药，能明显降低乙型肝炎患者血清透明质酸、Ⅲ型前胶原、层粘蛋白、Ⅳ型胶原。前期动物实验表明Art对CCl4混合因素造成的大鼠肝纤维化有防治作用。肝纤维化的发生原因有许多，任何致病因子造成的肝脏损害和炎症，均可引起纤维组织增生及沉积而形成肝纤维化。大鼠免疫性肝纤维化模型更接近人类肝纤维化的病理机制［8］。实验中观察到大鼠在造膜结束后肝组织Masson胶原染色可见由胶原纤维构成的纤维间隔自汇管区向肝小叶内延伸，交织成网状。经Art预防治疗后，大鼠胶原纤维增生程度明显减轻，甚至无胶原纤维增生或仅在汇管区和中央静脉有少量纤维组织增生，其纤维化程度明显低于模型组。模型组肝组织Hyp含量明显升高，而Art组明显下降，这与肝组织形态学观察反映出的各组肝纤维化程度相一致。

HSC的活化和增殖在肝纤维化的发生、发展过程中起关键作用。表达α-SMA是HSC活化的标志。实验中观察到正常大鼠肝脏几乎无 α-SMA mRNA的表达，肝纤维化大鼠肝组织α-SMA mRNA表达增高，而Art组可以抑制α-SMA mRNA表达，从而推断Art抑制肝纤维化与抑制HSC活化有关。

肝细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞等受损后释放的TGF-β1是启动邻近静息态HSCs激活和转化的初始信号之一。而后由HSC通过自分泌方式使 TGF-β1持续增高，TGF-β1反馈作用于 HSCs，并不断刺激自身的增殖并合成Ⅰ型胶原等各种细胞外基质在肝内异常沉积，最终导致肝纤维化［9］。有研究证实［10］，细胞因子中只有 TGF-β1能刺激 HSC 合成胶原纤维，而其他细胞因子则只刺激 HSC增殖。实验当中正常大鼠肝组织几乎未见TGF-β1表达，模型组高表达，提示TGF-β1的表达与纤维化的形成与发展是密切相关的。Art可以抑制肝组织TGF-β1mRNA的表达。

体外以 HSC-T6 为对象，用 5 μg·L-1TGF-β1刺激HSC-T6，结果所示活化后的HSC-T6对TGF-β1刺激信号仍是敏感的，经过TGF-β1刺激，Ⅰ型前胶原mRNA表达增高，Ⅰ型胶原蛋白分泌增多，与Art共培养后发现Ⅰ型胶原的量比单独使用TGF-β1刺激时明显减少。表明Art对HSC有直接抑制作用。其机制可能在于影响TGF-β1细胞内信号转导，从而下调细胞内Ⅰ型前胶原的基因转录，进而抑制Ⅰ型胶原的产生，起到抑制肝纤维化的作用。Art对TGF-β1受体后信号通路的影响有待于进一步的研究。

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