七氟醚和异氟醚对不同浓度罗库溴铵抑制乙酰胆碱受体内向电流的影响

刘 力，闵 苏，魏 珂

罗库溴铵(rocuronium，Roc)是临床上常用的非去极化肌松剂，能与乙酰胆碱(acetylcholine)竞争性结合神经肌接头突触后膜成人型乙酰胆碱受体(εnAChR)，阻断神经冲动传导，发挥肌松作用。麻醉诱导时采用预注小剂量肌松剂来提高肌松起效时间，但不能增强肌松程度。挥发性吸入麻醉药能够明显增强非去极化肌松剂的肌松作用，两种药物复合用于麻醉诱导能够加快起效时间并提高肌松效果。本实验通过脂质体转染建立表达大鼠ε-nAChR的HEK293细胞模型［1］，比较两种常用的挥发性吸入麻醉药七氟醚(sevoflurane，Sev)和异氟醚(isoflurane，Iso)对不同浓度罗库溴铵与ε-nAChR结合后内向电流的影响，以阐明挥发性吸入麻醉药复合不同剂量非去极化肌松剂的浓度效应关系。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 罗库溴铵标准品，批号:X1-081201，由仙琚公司 (中国)提供。七氟醚、异氟醚购自美国雅培公司。细胞培养和转染相关试剂分别购于美国Sigma公司和Invitrogen公司。

1.2 载体质粒的构建 从成年大鼠骨骼肌匀浆中提取 ε-nAChR 亚基 α、β、δ、ε 基因，分别插入原核细胞表达质粒后通过测序鉴定，再亚克隆到真核细胞表达质粒pcDNA3.1。基因测序鉴定pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDNA3.1δ、pcDNA3.1ε 4 种载体质粒连接正确(载体质粒由广州弗尔博生物公司构建)。

1.3 细胞培养 HEK293细胞株(重庆医科大学分子生物实验室提供)在37℃、含5%CO2的培养箱中用DMEM培养基(Hyclone公司 含体积分数为10%小牛血清、1 ×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1链霉素、2 mmol·L－1谷氨酰胺)培养24 h。培养2～3 d和实验前用0.25%胰酶消化传代1次(密度为1×105)。

1.4 HEK293细胞脂质体转染及功能鉴定 将pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDNA3.1δ、pcDNA3.1ε以2∶1∶1∶1比例与10 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)混合，加Opti-MEM培养基至1 ml，孵育20 min后，加入HEK293培养皿中。培养8 h后更换为DMEM培养基，再培养24 h即行膜片钳检测。用空pcDNA3.1质粒转染HEK293细胞作为阴性对照。不含目的基因质粒转染的HEK293细胞，ACh(Sigma公司，美国)不能激发电流;而含目的基因的质粒转染的HEK293细胞，ACh可激发电流。

1.5 挥发性吸入麻醉药饱和灌流液的制备 50 ml的七氟醚或异氟醚(雅培公司，美国)加入到充满400 ml灌流液的密封玻璃瓶中，在室温下平衡24 h以上。通过气相色谱仪(HP6890)测定浓度。

1.6 电生理记录 用配置好的细胞外液(NaCl 140 mmol·L－1、KC1 5.4 mmol·L－1、CaCl21.8 mmol·L－1、MgCl 1.0 mmol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1、葡萄糖 11.1 mmol·L－1、阿托品 1 μmol·L－1，以NaOH调pH至7.4)替换细胞培养基，以1～2 ml·min－1速度灌注。电极内液成分为CsC1 150 mmol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1、EGTA 5 mmol·L－1、Mg-ATP 2 mmol·L－1，以 CsOH 调 pH 至7.3。用 PC-10微电极拉制仪(Narishige公司 日本)拉制微电极。电极电阻为2～5 MΩ。应用全细胞膜片钳记录电流。电刺激脉冲的给出及电信号的采集通过digidatal 1200放大器(美国Axon Instruments公司)完成。采样频率1 000 Hz，低通Bessel滤波0.5 kHz。封接电阻大于1 GΩ时，吸破细胞膜成全细胞状态。

1.7 分组和给药方式 分别用6种不同浓度的罗库溴铵标准品和七氟醚、异氟醚平衡溶液处理重组HEK293 细胞 30 s，再给予 100 μmol·L－1ACh，记录峰电流。给肌松药前后单用ACh激动受体，记录的电流的平均值作为基础值。给药间隔2～3 min，并用细胞外液持续冲洗，以减少细胞脱敏感。拟合罗库溴铵和七氟醚、异氟醚的量效曲线，得出3种药物的半数有效抑制浓度(IC50)。实验根据罗库溴铵的浓度分为 Roc(IC5)、Roc(0.5 IC50)、Roc(IC50)3大组，每组根据处理不同分为七氟醚组 (Sev组)和异氟醚组(Iso组)。各组用0.5 IC50的吸入麻醉药水溶液处理重组细胞1 min后，分别用相应浓度的罗库溴铵处理细胞 30 s，给予 100 μmol·L－1ACh，记录峰电流。各组以单纯使用相应浓度的罗库溴铵为对照。

1.8 数据分析 采用Clampex和Clamfit软件进行电流图形、数据处理。计量资料以±s表示。电流抑制率=1－［(测得峰电流/两次给ACh后电流平均值)×100%］。量效曲线的拟合用Origin软件(Microcal Software公司，美国)完成，其中IC50用Hill公式得出。统计分析采用SPSS 18.0软件的单因素方差分析，组间比较用LSD法。

2 结果

2.1 载体质粒构建鉴定 用ACh对含目的基因质粒转染的HEK293细胞、不含目的基因质粒转染的细胞和未转染的细胞激动受体的膜片钳功能鉴定(Fig 1)。ACh只能激动含目的基因质粒转染的HEK293细胞的内向电流，而对空质粒转染细胞和无转染细胞无激动作用。

Fig 1 Acetylcholine(100μmol·L－1)induced currents in untransfected cell HEK293 cell transfected by non-target gene plasmid，and HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

2.2 罗库溴铵、七氟醚和异氟醚对ε-nAChR抑制作用的量效关系 罗库溴铵、七氟醚和异氟醚对重组HEK293细胞上 ε-nAChR的 IC50的值分别为:(150.45±12.5)μmol·L－1(95%置信区间115.70 μmol· L－1～ 185.19 μmol· L－1)。(824.27 ±14.73)μmol·L－1(95% 置信区间 783.36 μmol·L－1～865.17 μmol·L－1);(1031.53 ±62.91)μmol·L－1(95%置信区间 856.85 μmol·L－1～1206.22 μmol·L－1)。3种药物对 ε-nAChR呈剂量依赖性的阻断作用。其作用强度为罗库溴铵＞＞七氟醚＞异氟醚，差异有统计学意义(P＜0.05)。见Fig 2、3。

Fig 2 Concentration-effect curves of rocuronium for inhibition of acetylcholine-induced(100 μmol·L －1)currents in HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

Fig 3 Concentration-effect curves of isoflurane and sevoflurane for inhibition of acetylcholine-induced(100 μmol·L －1)currents in HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

2.3 浓度为0.5 IC50七氟醚、异氟醚预处理对3种不同浓度的罗库溴铵抑制ε-nAChR内向电流幅度的影响 用浓度为0.5 IC50的七氟醚、异氟醚溶液处理ε-nAChR后，罗库溴铵抑制ACh诱发ε-nAChR内向电流的抑制率与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。Sev和Iso各处理组中进行组内比较，ROC1组与ROC2、ROC3组的内向电流抑制率差异均有统计学意义(P＜0.01)。ROC2组与ROC3组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。Sev和Iso两处理组相同浓度水平的罗库溴铵进行组间比较，ROC1组的内向电流抑制率差异有统计学意义(P＜0.01)。ROC2组和ROC3组的内向电流抑制率差异均无统计学意义(P＞0.05)。见Fig 4。

Fig 4 Compare inhibition rate of inward current of acetylcholine receptors between three different concentration of rocuronium after pretreatment of sevoflurane and isoflurane(±s)＊＊P＜0.01 vs Roc(IC5);△△P＜0.01 vs Roc(0.5 IC50);##P＜0.01 vs Sev+Roc;★★P ＜0.01 vs Iso+Roc

3 讨论

挥发性吸入麻醉药能增强NDMRs的肌松作用，其作用机制可能与挥发性吸入麻醉药结合nAChR的位点促进NDMRs与受体的结合有关。挥发性吸入麻醉药与nAChR受体跨膜区中的M2区结合促进NDMRs与nAChR的α-ε与α-δ亚基交界处的受体胞外部结合，增强抑制nAChR通道电流，阻滞通道开放［2］。本研究结果表明异氟醚、七氟醚存在条件下，非去极化肌松剂对结合位点亲和力的变化导致离子通道功能改变的效应［3］。临床上进行麻醉诱导时，常预给小剂量的肌松剂后再给予插管所需剂量的肌松剂。该方法虽能明显提高肌松剂的起效时间，但不能增强肌松效果，因而导致药物的浪费。挥发性吸入麻醉药复合小剂量肌松剂用于麻醉诱导可能充分发挥肌松协同作用达到插管剂量的肌松效果。本研究证明罗库溴铵在较低的浓度水平时，七氟醚、异氟醚均能发挥明显的协同作用，异氟醚作用略强于七氟醚。随着罗库溴铵剂量的进一步增加，七氟醚、异氟醚的协同能力相似且趋于缓和。该结果提示在麻醉诱导时预给小剂量肌松剂复合一定浓度的挥发性吸入麻醉药能发挥单次大剂量肌松剂同等的肌松作用。本实验中为了比较异氟醚和七氟醚对NDMRs增强效应，使用挥发性麻醉药的等效浓度使其具有相近的nAChR阻滞能力。根据文献报道吸入麻醉药等效抑制浓度与MAC换算关系［4］，浓度为 0.5 IC50的异氟醚相当于 1.8MAC;浓度为0.5 IC50的七氟醚相当于1.3 MAC。有临床研究报道该MAC浓度的异氟醚和地氟醚对维库溴铵的增强效应相同［5］。这与本研究中异氟醚和七氟醚对高剂量的罗库溴铵的协同作用结果相似。

本实验运用分子生物学基因重组和受体克隆技术，构建表达大鼠骨骼肌成人型乙酰胆碱受体的细胞模型。该方法已被国内外广泛用于研究肌肉和神经型乙酰胆碱受体［6－7］。本实验中仅涉及异氟醚、七氟醚对罗库溴铵抑制ε-nAChR峰电流的影响，尚需进一步研究对ε-nAChR通道开放的时效影响。

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