斑马鱼谷氨酸功能低下精神分裂行为模型的建立

颜 慧，宫泽辉

斑马鱼是一种小型亚热带淡水鱼，因体侧有银蓝色的纵向条纹而得名。斑马鱼具有近似人类的各种器官系统并且具有相似的功能，如心脏血管系统、消化系统、神经系统，因此斑马鱼作为一种新型的模生物已广泛用于研究脊椎动物的胚胎发育，而近年来随着研究的深入，斑马鱼在疾病研究、药物筛选及毒性试验中的作用也逐渐引起关注［1－4］。

斑马鱼与神经精神药理相关的行为研究在国内外的进展不一，近几年国外利用不同装置针对斑马鱼的复杂行为表现建立了多种行为模型，如自发活动模型、新奇事物探索模型、黑/白箱偏爱模型等［5－9］，而国内目前尚未见系统性报道。

NMDA受体拮抗剂——地卓西平马来酸盐［(+)MK-801］是致动物精神分裂模型中常用的工具药之一，能诱导动物产生活动增多、刻板行为、认知和感觉运动门控障碍、社会接触能力损害等异常行为表现，这些表现与精神分裂症的症状有某些一致性［10－11］。

本实验利用自行设计斑马鱼行为视频跟踪分析系统，观察斑马鱼游泳行为，确定行为指标，用MK-801预处理建立药物致谷氨酸功能低下精神分裂症行为模型，并考察不同药物对于斑马鱼行为的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 成年3～6个月斑马鱼，AB品系，♀♂不限，由军事医学科学院毒物药物研究所赵宝全博士惠赠。利用斑马鱼独立养殖单元进行培养，每8条置于3 L水箱中，培养至少15 d以适应实验环境。鱼水由纯净水添加海盐配制而成。室温与水温控制在(28±2)℃，光照自动控制(光照时间8:00～18:00)，正常喂食，每天两次。所有的鱼均为首次实验。

1.2 材料 地卓西平马来酸盐，纯度＞98%，日本Wako公司，批号:PEG1079，色谱级，以鱼水配制浓度为3.4 mg·L－1;氯氮平(clozapine)，黄色粉末，纯度＞90%，由军事医学科学院毒物药物研究所黄世杰教授惠赠，使用时先以1 mol·L－1盐酸配制为 5 g·L－1母液，再以鱼水稀释;奥氮平(olanzapine)，美国Lily公司，批号:A689380，每片含奥氮平5 mg，使用时先研成粉末，而后加入0.1 mol·L－1盐酸充分溶解，高速离心后取上清液，以加入的溶液总体积计算配制成4 g·L－1母液，再以鱼水稀释。

1.3 仪器 斑马鱼独立养殖单元ESEN-AW-SS-1(北京爱生科技发展有限公司);斑马鱼游泳行为视频跟踪分析系统(安来科技有限公司)。

1.4 动物分组与药物处理 斑马鱼分为6组(n=8～10):正常组(斑马鱼在300 ml鱼水中暴露1 h);MK-801组(鱼在同体积含3.4 mg·L－1MK-801的水体中暴露1 h);氯氮平组(鱼在同体积5 mg·L－1氯氮平的水体中暴露30 min);奥氮平组(鱼在同体积 4 mg·L－1奥氮平的水体中暴露30 min);氯氮平预防组，在预防组中，鱼在同体积5 mg·L－1氯氮平的水体中暴露30 min后，再转入含3.4 mg·L－1MK-801的水体中处理1 h;奥氮平预防组，除了预先暴露于4 mg·L－1奥氮平外，其他操作同氯氮平预防组。

1.5 行为测试方法 测试方法参考文献［5，12－13］并略加改进，行为测试装置为1.5 L梯型鱼箱(15.2 cm高×7.1 cm宽×27.9 cm顶面长×22.5 cm底面长)，行为测试时，鱼箱最大程度地装满水，光照强度与之前的培养条件相同，每条鱼放于测试箱中，分别从水平与垂直两个方向视频记录游泳行为，分析首6 min的运动数据。利用视频软件将观察箱垂直方向等分为上下两个分区，水平方向等分为4个分区，记录运动轨迹及各项运动指标。而后人工根据视频资料分析统计不规则运动及呆滞动作频率，作为反映斑马鱼行为的附加指标。

不规则运动的定义:在运动方向和(或)速度的急剧变化及重复的快速急进行为。呆滞行为的定义:除了鳃和眼活动外，完全不运动超过2 s。

1.6 统计学分析 利用GraphPad Prism 4软件绘制曲线与统计学检验，实验数据采用±s表示。组间比较采用oneway ANOVA进行分析，Newman-Keuls test进行组间后检验。

2 结果

2.1 不同药物对于斑马鱼运动轨迹的影响 Fig 1显示不同条件下斑马鱼在观察箱中6 min内的垂直方向的运动轨迹，正常情况下斑马鱼进入新环境后，多数会沿测试箱边界表现明显的探索兴趣，从运动轨迹上可见正常组斑马鱼上下穿梭较频繁，鱼在箱壁附近活动较多。MK-801处理使得斑马鱼在上部的运动距离明显增加，氯氮平有使斑马鱼穿梭减弱的趋势，单独给予奥氮平并不影响斑马鱼的运动轨迹，而药物预防组中，会降低斑马鱼的穿梭次数，使鱼的运动集中于上部。

Fig 1 Computerized video tracks of zebrafish behavior in the tank in first 6 min after exposed to different experimental challenges

2.2 不同药物对于斑马鱼垂直方向运动的影响 药物处理斑马鱼后的垂直运动方向的运动路程与穿越次数的变化如Fig 2所示。MK-801预处理组垂直运动路程比正常对照组增加32%(P＜0.05)，而氯氮平与奥氮平预处理组与正常组无变化;与MK-801组相比，氯氮平+MK-801组的垂直运动降低40%，奥氮平+MK-801组降低37%(P＜0.01)。

Fig 2 Total vertical travel distances and transitions of zebrafish in first 6 min(±s，n=8～10)A:Vertical travel distance(cm);B:Vertical transitions.Zebrafish was exposed to different experimental challenges in a pre-treatment beaker before being transferred into the tank for behavioral observation.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs the normal group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs the MK-801 group

MK-801预处理组垂直方向运动路程的增加，是由于鱼在上半区的高速运动所产生的，与之对应的是与正常组相比，MK-801预处理组的垂直穿越次数下降约59%(P＜0.01)，氯氮平组下降约71%(P＜0.01)，而奥氮平组与正常组相比差异无显著性;与MK-801组相比，氯氮平+MK-801组和奥氮平+MK-801组虽然差异无显著性，但垂直穿越次数更加减少;与正常组相比，氯氮平+MK-801组的垂直运动降低87%，奥氮平+MK-801组降低90%(P＜0.01)。值得注意的是，单独给予奥氮平并不引起垂直穿越的明显变化，而一旦与MK-801合用，却引发穿越次数非常明显的下降。

2.3 不同药物处理对于斑马鱼水平方向运动的影响 水平运动路程与水平穿越次数的变化规律一致(Fig 3)，与正常组相比，6 min内MK-801组的水平运动路程与穿越次数分别增加69%和47%(P＜0.01)，而氯氮平与奥氮平单独预处理组与正常组无变化，而与MK-801组相比，氯氮平+MK-801组的水平运动路程减少33%(P＜0.01)，水平穿越次数降低43%(P＜0.01);与MK-801组相比，奥氮平+MK-801组的水平运动路程降低27%(P＜0.05)，水平穿越次数降低36%(P ＜0.01)。

Fig 3 Total horizontal travel distances and transitions of zebrafish in first 6 min(±s，n=8～10)A:Travel distance(cm);B:Horizontal transitions.＊＊P ＜0.01 vs the normal group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs the MK-801 group

2.4 不同药物处理条件下斑马鱼异常行为指标的变化 在实验中，同方向同区域连续转3圈记为一次异常行为，急停、急转一次记为一次异常行为。在MK-801预先处理组中，斑马鱼表现出持续在上半分区进行重复的高速转圈、急停急转等异常行为，与正常组相比差异有显著性(P＜0.01)，氯氮平+MK-801组中，斑马鱼的运动速度减缓，转圈行为减少，与MK-801组相比异常行为明显改善(P＜0.01)，但与正常组相比，仍有明显的急速转身行为(P＜0.01);奥氮平+MK-801组中，斑马鱼运动速度未受影响，但仍有重复转圈行为，在明显降低MK-801引起的异常行为(P＜0.01)同时，与正常组相比差异有显著性(P＜0.01)，见Fig 4。

Fig 4 Frequency of abnormal movements of zebrafish in first 6 min±s，n=8～10)＊＊P＜0.01 vs the normal group;##P＜0.01 vs the MK-801 group

3 讨论

斑马鱼作为新的模式动物，在给予不同刺激条件下，其复杂的行为模式与精神神经障碍行为相关性的研究已逐渐引起研究者的关注。根据文献报道［5－9］，利用梯形测试箱，焦虑与恐惧、药物依赖与戒断等相关的行为指标已在斑马鱼模型中确定，其中上下穿梭次数、游泳速度与运动距离、呆滞与异常游泳动作是评价模型建立的主要指标。

本实验用MK-801预处理后，从水平和垂直两个方向观测的结果均可看到斑马鱼的运动距离明显增加，这与小鼠模型上的运动亢进相一致。MK-801引发的斑马鱼刻板转圈与急冲急转行为，与小鼠模型中小鼠的刻板转圈跑动、突然冲撞相吻合。另外，MK-801处理后，斑马鱼表现为长时间在上部高速游泳，从定量指标反映为运动路程增加，垂直穿越次数降低，而这些指标在大小鼠等传统造模动物上是无法获取的。在国外研究斑马鱼行为模型中，垂直穿越次数减少是动物焦虑与抑郁行为的重要指标［12－14］。

实验中选用的阳性药氯氮平是第一个非经典抗精神病药物，其中枢作用机制较为复杂，除对5-HT2和DA受体的亲和力较强外，还可作用于中枢神经系统的多种神经受体而产生多相效应，在临床表现出治疗的广谱性，同时也由于这种作用复杂性，在临床上也出现矛盾效应，文献报道［15］在动物模型上氯氮平加重共济失调，这可能与其对胆碱能受体的拮抗作用相关。本试验中观察到氯氮平单药也使斑马鱼垂直穿越次数减少，与MK-801合用可以缓解其引发的运动亢进、刻板行为增加等类似阳性症状的行为，但对垂直穿越行为几乎完全抑制。这与氯氮平对精神分裂症的阴性症状疗效欠佳是一致的，我们分析可能与药物的作用机制密切相关。

奥氮平是一种新开发的非经典抗精神病药物，对DA2受体的选择性较强，单药对斑马鱼的行为轨迹无明显影响，但对MK-801所致的斑马鱼运动行为异常的干预作用与氯氮平相近，虽能缓解其运动亢进，但也抑制垂直穿越行为，推测与受体亚型的亲合力不同相关，其确切机制有待进一步研究。

综上，预先给予不同化合物会使斑马鱼的游泳行为发生变化，与大小鼠模型相比，斑马鱼对神经系统药物反应的灵敏度较高，从水平与垂直两方向观察到的行为指标可提供更多的信息，能较全面地反映药物对动物行为的影响，另外，由于斑马鱼给药方式简单，需药量少，模型建立成本低等特点，相信其行为模型会在神经精神药理学研究具有广泛的应用前景。

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