铁包金总黄酮体内对S180实体瘤的抑制作用

陈小龙，滕红丽，沈玉霞，梅之南

铁包金为鼠李科植物老鼠耳的根。药材呈干燥根圆柱状，粗细不一，商品多锯成小段或切成厚片。栓皮结实，黑褐色或棕褐色，有网状裂隙及纵皱。质坚硬，断面本部甚大，质纹细致，暗黄棕色至橙黄色。产广东、福建等地。具有化瘀血，祛风湿，消肿毒。治肺痨久咳、喀血、吐血、跌打损伤、风湿疼痛、痈肿、荨麻疹等症。临床上用于治疗小儿胃纳呆滞、精神病、慢性气管炎等。经中南民族大学民族药物研究所天然药化分析，铁包金的主要成分是黄酮类化合物，还包括蒽醌二聚体、木质素等。近年来，对黄酮类化合物的研究表明:黄酮类化合物具有抗心血管疾病，抗炎及提高机体免疫力，雌激素样等作用。我们对铁包金的抗肿瘤作用进行了实验研究，对铁包金所含物质进行了初步测定，使用S180小鼠模型进行了体内抗肿瘤试验。现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 瘤株和动物 小鼠S180瘤株，中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心);SPF级昆明种小鼠，武汉生物制品研究所，动物许可证号:SCXK(鄂)2008－0003。

1.2 药品及试剂 实验药物铁包金采于广西，经中南民族大学民族药物研究所植物分类鉴定为鼠李科植物铁包金(Berchemia lineata(L)DC［Rhamnus lineata L］)的根。铁包金药材粉碎，用8倍量体积分数为70%乙醇加热回流提取3次，时间分别为1、1、0.5 h。提取液浓缩，抽滤后蒸干。甲醇溶出，石油醚萃取除酯，醇部位浓缩既得粗黄酮粉，备用。以儿茶素为标准品紫外定标曲线法检测其总黄酮含量为63.2%。SOD、MDA试剂盒，南京建成公司;免疫组化试剂盒，武汉BOSTER公司。

2 方法

2.1 铁包金总苷酮对S180实体瘤的抑制作用 无菌条件下取接种d 7生长良好的S180瘤源动物的腹水，立即至于灭菌后的锥形瓶中，以注射用生理盐水按1∶3比例稀释成瘤细胞悬液，并计数调整细胞浓度为每毫升2×106个活瘤细胞。取50只小鼠，♂♀各半，每只小鼠右前肢腋下皮下注射接种0.2 ml。接种后次日称重，随机分成5组，空白对照组(给予等体积蒸馏水)、阳性对照组(顺铂组浓度2.5 mg·kg－1，腹腔注射)、铁包金总黄酮高、中、低剂量组(剂量分别为 480、240、120 mg·kg－1)，连续给药 10 d。末次给药24 h后称重，脱臼处死动物，剪开肿瘤部位，完整剥离瘤块，用滤纸吸净其上液体，称取瘤块重量，计算抑瘤率。并且分离胸腺、脾脏和肝脏，精密称重，计算胸腺、脾脏和肝脏指数。

Tab 1Influence to S180 tumor-burdened mice tumor growth(±s，n=10)

Tab 1Influence to S180 tumor-burdened mice tumor growth(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d－1Weight/g Before After Tumor weight/g Inhibition rate/%Control － 21.63 ±0.92 23.62 ±1.69 1.43 ±0.21 －Cisplatin 2.25 20.14 ±0.85 15.61 ±1.32＊＊ 0.24 ±0.14＊＊ 83.22 High 480 20.62 ±0.99 23.24 ±1.71 0.71 ±0.21＊＊ 50.35 Middle 240 20.01 ±1.08 22.03 ±1.51 0.92 ±0.28＊＊ 35.66 Low 120 21.23 ±1.47 23.41 ±1.19 1.10 ±0.11＊＊23.08

Tab 2 Influence to index of thymus，spleen and liver ± s，n=10)

Tab 2 Influence to index of thymus，spleen and liver ± s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d －1 Index of thymus/mg·g－1 Index of spleen/mg·g－1 Index of liver/mg·g －1 Control － 3.61 ±1.01 14.02 ±1.20 61.95 ±6.56 Cisplatin 2.25 0.93 ±0.30＊＊ 4.07 ±0.47＊＊ 48.39 ±3.30＊＊High 480 3.99 ±0.88 12.25 ±1.18 54.58 ±6.31 Middle 240 3.61 ±0.72 13.09 ±1.97 61.36 ±6.23 Low 120 3.62 ±0.76 13.39 ±0.52 61.40 ±6.83

2.2 测量血液的SOD值和MDA值 处死前，摘除眼球取血，离心后保留血清备用。按照试剂盒说明书，预试验后取 30 μl测 SOD 值，取 100 μl测MDA值。

2.3 HE染色和免疫组化 瘤块称重后，立即置于4%多聚甲醛中固定4 d，之后置于30%的蔗糖-TBS缓冲液中脱水至肿瘤沉底。修整后石蜡切片(厚5 μm)，常规HE染色观察。结果判定:低倍镜下(×40)观察坏死面积，按坏死面积大小分级判断为灶状坏死(+)、小片状坏死)、大片状坏死)。冰冻切片(20 μm)，步骤按试剂盒说明，DAB显色，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。根据检测的目标蛋白一抗分别p53单克隆抗体，TNF-α单克隆抗体，Caspase-3单克隆抗体，均以棕黄色的强弱程度为观察指标。

3 结果

3.1 铁包金总黄酮对S180实体瘤的抑制作用Tab 1表明，与空白对照组比较，铁包金总黄酮的高、中、低剂量组和顺铂组皆有抑制S180肉瘤生长作用(P＜0.01);铁包金总黄酮组随给药剂量的增大，抑瘤作用逐渐增强，且显示出明显的剂量依赖性，顺铂组的抑瘤效果优于给药组(P＜0.01)，但顺铂组对于小鼠体重增长有明显的影响，与空白对照组相比差别有显著性(P＜0.01)，说明顺铂在抑制肿瘤生长的同时对机体有明显的毒副作用。而铁包金总黄酮各给药组的小鼠体重与空白组相比差别无显著性(P＞0.05)。Tab 2表明，与空白对照组相比，顺铂组的小鼠胸腺、脾脏和肝脏指数明显降低，且差别有显著性(P＜0.01);铁包金总黄酮各给药剂量组的小鼠胸腺、脾脏和肝脏指数与顺铂组比较差别有显著性(P＜0.01)，与空白组比较差别无显著性(P＞0.05)。

3.2 铁包金总黄酮对S180小鼠体内SOD和MDA水平的影响 Tab 3表明，铁包金总黄酮各组升高小鼠的SOD值，且降低其MDA值，具有一定的量效关系。阳性组降低小鼠的SOD值，且升高其MDA值。与空白组相比差异有显著性(P＜0.01)。

Tab 3Influence to SOD and MDA in plasma(±s，n=10)

Tab 3Influence to SOD and MDA in plasma(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d －1 SOD/kU·L －1 MDA/μmol·L －1 Control － 44.59 ±1.20 9.14 ±0.63 Cisplatin 2.25 16.93 ±1.16＊＊ 10.63 ±1.03＊＊High 480 54.11 ±0.20＊＊ 7.41 ±0.18＊＊Middle 240 51.77 ±0.89* 7.93 ±0.35*Low 120 49.32 ±1.25* 8.11 ±1.10*

3.3 HE染色和免疫组化 低倍镜(×40)观察:高、中剂量组可见组织大片坏死。低剂量组和NS组坏死区域较小，细胞生长活跃。顺铂组则坏死区域较大，细胞处于凋亡状态(Fig 1)。结果见Tab 4。

以细胞内棕黄色强弱来判断肿瘤细胞内p53，TNF-α和Caspase-3蛋白表达量的变化。结果显示高、中、低各组 p53蛋白表达依次升高，TNF-α和Caspase-3蛋白表达依次降低。见Fig 2。

Fig 1 HE Dyeing results(×40)A:High;B:Middle;C:Low;D:Control;E:Cisplatin

Fig 2 Immnohistochemical results(×200)A:High;B:Middle;C:Low;D:Control;E:Cisplatin

Tab 4 Pathological statistical results(n=10)

4 讨论

铁包金是中国传统一味药材，具有消肿解毒，止血镇痛，祛风除湿等功效。本文对其抗肿瘤效果进行了研究，其对小鼠荷瘤具有很好的抑制作用，并且对小鼠机体没有伤害，没有顺铂的毒副作用。近年来国内外对自由基的研究发现，自由基产生过多或清除能力下降，与肿瘤的发生发展密切相关。各种理化致癌因子在体内经过代谢活化形成自由基形式，并与其它自由基一起富集于脂质细胞膜周围，引起脂质过氧化，破坏细胞的DNA而产生癌变。同时，自由基作用于脂质产生的过氧化物及其产物丙二醛等既能致癌，也能导致突变。由此，清除自由基成为一条有效的抗癌、抑癌手段。MDA(丙二醛)是脂质过氧化反应链式终止阶段产生的小分子产物:脂质过氧化物(LOOH)形成的环状过氧化物可断裂形成烯醛、丙二醛，其含量可以间接反映自由基的产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度。脂质过氧化越活跃，则生成的MDA越多。SOD是有效清除超氧化物阴离子自由基的一类重要的抗氧化酶，能阻止由O2－启动的自由基链锁反应。SOD的活力反映了机体清除氧自由基的能力。本实验主要测定了S180荷瘤小鼠血浆MDA和SOD含量，显示铁包金总黄酮能降低 S180荷瘤小鼠血浆 MDA，升高SOD含量。提示铁包金总黄酮抗肿瘤机制可能与清除自由基有一定关系。p53是一种肿瘤抑制基因，p53基因可以阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定、抑制肿瘤血管生成等作用。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。TNF-α具有一定的杀死癌细胞作用。很多的凋亡信号转导最后都是由Caspase来导致最后的凋亡的，凋亡包括内源性线粒体细胞色素释放途径和外源性死亡受体途径，而Caspase-3是最终凋亡执行分子，其表达量可以显示细胞凋亡的状态。经免疫组化研究可知，铁包金总黄酮能降低小鼠体内p53、Caspase-3，提升TNF-α蛋白的表达来抑制肿瘤的生长。其具体机制有待进一步研究。

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