青蒿琥酯通过下调TRAF6抑制LPS诱导心肌细胞炎症反应和细胞凋亡的实验研究

翟晓芳,秦国庆,梁晓清

心肌炎是临床常见心肌疾病,其症状主要有心律失常、急性心功能不全等。研究认为,心肌损伤如心肌细胞过度炎症反应及心肌细胞凋亡等与心肌炎的发生发展密切相关[1],抑制心肌损伤对心肌炎的治疗尤为重要。青蒿琥酯是青蒿素的一种半合成衍生物,具有抗炎、免疫调节等作用[2]。研究显示,青蒿琥酯可通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)/p65信号通路减轻脂多糖(LPS)诱导的人结肠上皮细胞炎性损伤,并促进细胞增殖,有望成为治疗结肠炎的药物[3];青蒿琥酯可通过激活黏附斑激酶/磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(FAK/PI3K/AKT)信号通路对缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡发挥抑制作用,其是治疗心肌缺血再灌注的替代药物[4]。但是,还鲜见青蒿琥酯影响脓毒症诱导的心肌损伤的相关报道。TRAF6是肿瘤坏死因子受体超家族和白细胞介素-1(IL-1)受体信号转导的关键衔接分子,其可通过激活核转录因子(NF)-κB信号通路参与调控细胞凋亡、氧化应激及炎症反应等过程[5]。既往研究显示,TRAF6参与心肌损伤的发展进程,过表达miR-506-3p可通过下调TRAF6抑制心肌组织炎症反应及心肌细胞凋亡,减轻心肌炎性损伤[6]。本研究建立LPS诱导的大鼠心肌细胞H9c2损伤模型,观察青蒿琥酯对LPS诱导的H9c2细胞炎症反应和细胞凋亡的影响及其能否通过调控TRAF6发挥作用,以期为脓毒症诱导的心肌损伤治疗提供新途径。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

H9c2细胞,上海通派生物科技有限公司;胎牛血清,浙江天杭生物科技股份有限公司;青蒿琥酯,纯度>98%,陕西藤迈生物科技有限责任公司;DMEM培养液、LipofectamineTM2000试剂盒、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白检测试剂盒和V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;蛋白质印迹实验所需抗体,中国Abcam公司;白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒,南京建成生物工程研究所有限公司;TRAF6过表达载体(pcDNA-TRAF6)和空载体(pcDNA),上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用完全培养液(含10 %胎牛血清的DMEM培养液)置于二氧化碳培养箱中培养H9c2细胞。

1.2.2 细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测细胞存活率

于96孔板中接种0.2 mL H9c2细胞(5.0×104个/mL),培养4 h。1)分别用含0、0.1、0.2、0.4 mmol/L青蒿琥酯的培养液孵育24 h[3];2)加含1 μg/mL LPS[7]的培养液诱导细胞2 h,并依次记为LPS组、LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组,同时设置对照组(Con组)常规培养,既不用青蒿琥酯孵育,也不用LPS诱导。各组培养结束后,向每孔中加10 μL CCK-8,孵育2 h,用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度(A)值。存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡

于6孔板中接种2.5 mL H9c2细胞(5.0×104个/mL),培养4 h后,按照上述1.2.2中的2)分组处理。各组培养结束后,收集细胞,用PBS清洗。加500 μL结合缓冲液,重悬细胞。加10 μL Annexin V-FITC,避光孵育15 min。再加5 μL PI,避光孵育5 min,利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡。

1.2.4 酶联免疫吸附法检测IL-1β、IL-6、TNF-α

于6孔板中接种2.5 mL H9c2细胞(5.0×104个/mL),培养4 h后,按照上述1.2.2中的2)进行分组处理。各组培养结束后,收集细胞上清液,3 500 r/min离心10 min。取上清,分别利用IL-1β、IL-6和TNF-α试剂盒采用酶联免疫吸附法检测其水平。

1.2.5 蛋白质印迹法检测TRAF6蛋白表达

于6孔板中接种2.5 mL H9c2细胞(5.0×104个/mL),培养4 h后,按照上述1.2.2中的2)进行分组处理。各组培养结束后,将细胞中总蛋白用RIPA试剂提取出来,并检测蛋白浓度(BCA法)。用SDS-PAGE实验对总蛋白进行分离,并转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),用5%脱脂奶粉封闭2 h。于4 ℃冰箱中分别用稀释的TRAF6和GAPDH(内参)一抗孵育过夜,稀释度均为1∶1 000。洗膜,用山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室温下孵育1 h。加显影液显影,曝光拍照,Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.6 细胞转染

于6孔板中接种2.5 mL H9c2细胞(5.0×104个/mL),培养24 h后,利用LipofectamineTM 2000试剂盒分别转染pcDNA、pcDNA-TRAF6,转染时间为12 h,蛋白质印迹法检测TRAF6蛋白表达验证转染效果。于6孔板中接种2.5 mL 转染pcDNA、pcDNA-TRAF6的H9c2细胞(5.0×104个/mL),按照LPS组处理,记为LPS+pcDNA组、LPS+pcDNA-TRAF6组;按照LPS+高青蒿琥酯剂量组处理,记为LPS+青蒿琥酯+pcDNA组、LPS+青蒿琥酯+pcDNA-TRAF6组。各组细胞处理后,按照上述1.2.3至1.2.5中方法检测细胞凋亡、炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达及TRAF6蛋白表达。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 青蒿琥酯对心肌细胞H9c2增殖活性的影响

不同剂量(0、0.1、0.2、0.4 mmol/L)青蒿琥酯组H9c2细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(99.02±1.64)%、(98.78±1.12)%、(99.67±0.33)%,4组间比较差异无统计学意义(F=2.835,P=0.054)。与0 mmol/L青蒿琥酯组比较,不同剂量(0.1、0.2、0.4 mmol/L)青蒿琥酯组H9c2细胞存活率比较差异均无统计学意义(P>0.05),说明此浓度范围内的青蒿琥酯对H9c2细胞无毒性。

2.2 青蒿琥酯对LPS诱导的心肌细胞H9c2增殖活性的影响

Con组、LPS组、LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组H9c2细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(62.14±1.70)%、(71.75±2.96)%、(80.13±1.69)%、(89.34±2.14)%,组间存活率比较差异有统计学意义(F=519.352,P<0.05)。LPS组H9c2细胞存活率低于Con组(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组H9c2细胞存活率均高于LPS组(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组H9c2细胞存活率两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 青蒿琥酯对LPS诱导的心肌细胞H9c2凋亡及炎性因子的影响

LPS组H9c2细胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均高于Con组(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组H9c2细胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均低于LPS组(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组各检测指标两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表1。

表1 青蒿琥酯对LPS诱导的H9c2细胞凋亡及炎性因子表达的影响(±s)

图1 青蒿琥酯对LPS诱导的心肌细胞H9c2凋亡的影响

2.4 青蒿琥酯对LPS诱导的心肌细胞H9c2中TRAF6蛋白表达的影响

Con组、LPS组、LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组H9c2细胞中TRAF6蛋白表达量分别为0.12±0.01、0.74±0.06、0.54±0.04、0.34±0.03、0.24±0.02,5组间TRAF6蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=413.727,P<0.05)。LPS组H9c2细胞中TRAF6蛋白表达量高于Con组(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组H9c2细胞中TRAF6蛋白表达量均低于LPS组(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯剂量组、LPS+中青蒿琥酯剂量组和LPS+高青蒿琥酯剂量组H9c2细胞中TRAF6蛋白表达量两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

图2 青蒿琥酯对LPS诱导的H9c2细胞中TRAF6蛋白表达的影响

2.5 TRAF6转染效率

TRAF6蛋白在转染pcDNA-TRAF6的H9c2细胞中的表达量为0.56±0.05,较转染pcDNA的H9c2细胞中的表达量0.14±0.02升高(t=-23.398,P<0.05),说明转染pcDNA-TRAF6的H9c2细胞中TRAF6较转染pcDNA的细胞上调。详见图3。

图3 TRAF6蛋白表达的检测

2.6 上调TRAF6逆转青蒿琥酯对LPS诱导的心肌细胞H9c2凋亡及炎性因子表达的影响

LPS+pcDNA-TRAF6组H9c2细胞中TRAF6蛋白表达、细胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均高于LPS+pcDNA组(P<0.05)。LPS+青蒿琥酯+pcDNA-TRAF6组H9c2细胞中TRAF6蛋白表达、细胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均高于LPS+青蒿琥酯+pcDNA组(P<0.05)。详见图4、图5及表2。

表2 上调TRAF6逆转青蒿琥酯对LPS诱导H9c2细胞凋亡及炎性因子表达的影响比较(±s)

图4 上调TRAF6逆转青蒿琥酯对LPS诱导的H9c2细胞凋亡的影响

图5 上调TRAF6逆转青蒿琥酯对LPS诱导蛋白表达的影响

3 讨 论

心肌炎发生发展与感染、自身免疫性疾病、物理化学刺激等多种因素有关。LPS又被称为内毒素,是革兰阴性菌细胞壁的主要成分,其可诱导心肌细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子,产生过度的炎症反应,进一步诱导心肌细胞坏死或凋亡,引发心肌炎[8]。本研究结果显示,大鼠心肌细胞H9c2经LPS诱导后,TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量明显增加,且凋亡率升高,说明LPS诱导H9c2细胞产生了炎症反应及细胞凋亡,模型建立成功。

青蒿琥酯具有多种药理活性。研究显示,青蒿琥酯对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞炎性因子释放具有显著抑制作用,这与其抑制细胞中Toll样受体4(TLR4)通路的活化有关[9];青蒿琥酯通过激活AKT/血红素氧合酶(HO-1)信号通路抑制过氧化氢(H2O2)诱导的晶状体上皮细胞氧化应激和细胞凋亡,提示其具有减轻白内障的作用[10];青蒿琥酯可抑制肾缺血再灌注引起的炎性因子释放及细胞焦亡,减轻肾缺血再灌注损伤[11];青蒿琥酯可抑制氧糖剥夺/复氧诱导的心肌细胞炎症、铁蓄积和脂质过氧化,减轻心肌细胞铁死亡,并增强细胞活力,缓解细胞损伤,提示青蒿琥酯具有心肌保护作用[12]。本实验首先观察到一定浓度范围的青蒿琥酯对心肌细胞H9c2无毒性,且青蒿琥酯可提高LPS诱导的H9c2细胞增殖活性,抑制细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子,同时减少细胞凋亡,这一结果与洪莉莉等[12]研究结果基本一致,说明青蒿琥酯可抑制LPS诱导的H9c2细胞炎症反应及细胞凋亡,提示其具有减轻或治疗脓毒症心肌损伤的作用,对心肌损伤具有保护作用。

有研究证实,TRAF6与心肌炎的发生发展密切相关[13]。下调TRAF6可通过抑制NF-κB通路诱导M2巨噬细胞极化,从而减轻病毒性心肌炎[14];miR-146a可通过靶向抑制TRAF6并阻碍NF-κB信号通路的激活改善心肌炎[15]。本研究显示,心肌细胞H9c2经LPS诱导后,细胞中TRAF6蛋白表达增加,而过表达TRAF6促进LPS诱导的心肌细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子,促进细胞凋亡,这提示TRAF6对心肌炎发生发展起促进作用。为了探究青蒿琥酯能否通过调控TRAF6影响LPS诱导的H9c2细胞炎性因子表达和细胞凋亡,本研究检测了其对LPS诱导的H9c2细胞中TRAF6蛋白表达的影响,结果显示,青蒿琥酯呈剂量依赖性抑制LPS诱导的H9c2细胞中TRAF6蛋白表达;同时恢复实验结果显示,过表达TRAF6逆转了青蒿琥酯对LPS诱导的H9c2细胞炎性因子及细胞凋亡的抑制作用,这提示青蒿琥酯通过下调TRAF6来抑制LPS诱导的H9c2细胞炎性因子表达及细胞凋亡,进而发挥心肌保护作用。

综上所述,一定剂量的青蒿琥酯对LPS诱导的H9c2细胞炎性因子表达及细胞凋亡具有抑制作用,这可能与其下调了细胞中TRAF6蛋白表达有关,具有治疗心肌炎的潜在价值。