α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯水解酶产生菌发酵培养基的响应面优化

袁 帅，王 普，何军邀

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032）

α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯水解酶产生菌发酵培养基的响应面优化

袁 帅，王 普，何军邀

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032）

对耐酪氨酸冢村氏菌（Tsukamurellatyrosinosolvens）E105菌株生物拆分外消旋体α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯制备左乙拉西坦关键手性中间体（S）-α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的发酵培养基进行优化，以提高其产酶活力.首先考察了碳源和氮源对菌种产酶活力的影响，并通过Plackett－Burman实验得出影响该菌株产水解酶的最主要因素为酵母粉质量浓度和初始pH值.继而采用中心组合实验并结合响应面分析优化发酵培养基组成，确定了最佳的酵母粉质量浓度为12.1 g／L，最佳的初始pH值为7.06.在优化的条件下酶活力可达1 024.6 U／mL，较优化前提高了67%，表明采用响应面法优化发酵培养基组成是提高该菌株产酶活力的有效途径之一.

α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯；冢村氏菌；水解酶；响应面优化

左乙拉西坦（Levetiracetam，LEV，商品名Keppra®）是比利时联合化学公司（UCB）研发的新一代抗癫痫药物（AEDs）［1］，化学名为（S）-α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酰胺［2］，为具有吡咯烷酮结构的促智药［3］.由于其独特的抗癫痫机制，较理想的药代动力学、高效安全的临床效果，不与其他AEDs发生作用以及较少的副作用等特点［4－7］，1999年FDA正式批准将其用于16岁以上成人部分性癫痫发作的添加治疗，2005年又将适应症扩大到4岁以上儿童［8－9］.目前，LEV已在欧美广泛使用［10］，2006年获准在我国上市.目前报道的LEV制备方法主要采用化学合成，包括手性源法，手性拆分和不对称合成［3，11］.但上述方法在制备LEV的过程中存在原料成本高、反应步骤繁琐、环境污染大等问题.近年来，生物催化手性合成技术的发展为LEV的制备提供了新的途径.国内外关于生物催化制备LEV的报道很少，仅见Tucker等［12］通过构建产腈水合酶NH33的大肠杆菌基因工程菌，利用其细胞裂解液拆分外消旋α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙腈制备 LEV，产率和e.e.值分别为46.1%和92%.（S）-α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸是合成 LEV 的关键手性中间体［13－14］.本课题组前期已筛选得到一株可拆分外消旋α－乙基－2－氧-1-吡咯烷乙酸乙酯制备高光学活性（S）-α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的微生物菌株——耐酪氨酸冢村氏菌（Tsukamurellatyrosinosolvens）E105.利用该菌株进行生物催化拆分时，当产物（S）-α－乙基－2－氧-1-吡咯烷乙酸的e.e.值为99%时，产率可达到48%以上.有关利用Placktte-Burman设计和响应面法优化发酵培养基组成以提高菌种产酶活力已有一些文献报道［15－18］.笔者在课题组菌种筛选的基础上，通过对耐酪氨酸冢村氏菌（Tsukamurellatyrosinosolvens）E105菌株发酵培养基中碳源和氮源种类的单因素考察，继而利用Placktte-Burman设计和响应面法优化得到最佳产酶培养基组成，旨在提高该新筛选所得菌株的产酶活力.

1 材料与方法

1.1 菌 种

耐酪氨酸冢村氏菌（Tsukamurellatyrosinosolvens）E105，本实验室自行筛选获得.

1.2 培养基及培养条件

斜面培养基：葡萄糖10.0 g／L，蛋白胨5.0 g／L，酵母粉2.0 g／L，（NH4）2SO42.0 g／L，K2HPO42.0 g／L，KH2PO41.0 g／L，NaCl 0.6 g／L，MgSO4·7H2O 0.6 g／L，琼脂15.0 g／L，pH 7.0，30℃培养48 h.

种子培养基：葡萄糖10.0 g／L，蛋白胨5.0 g／L，酵母粉2.0 g／L，（NH4）2SO42.0 g／L，K2HPO42.0 g／L，KH2PO41.0 g／L，NaCl 0.6 g／L，MgSO4·7H2O 0.6 g／L，pH7.0.种子培养条件为30℃，200 r／min培养24 h.

初始发酵培养基组成同种子培养基.接种量体积分数为4%，250 mL摇瓶的装液量为70 mL，30℃，200 r／min培养36 h.

1.3 生物催化合成（S）-α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸

菌体培养36 h后，发酵液于4 500 r／min离心10 min，收集菌体，并用0.1 mol／L的磷酸缓冲液（pH 8.0）洗涤，离心，收集湿菌体.取细胞干重（DCW）为0.2 g的湿菌体，将其重新悬浮于10 mL磷酸缓冲液（0.1 mol／L，pH 8.0）中，加入100μL外消旋的α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯，置旋转式摇床200 r／min，30℃进行生物转化反应，其生物拆分原理为

1.4 菌体量测定

细胞干重法.

1.5 α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸浓度测定

按1.3方法进行生物转化1 h后，反应液于8 000 r／min离心10 min，取上清液，0.45μm微滤，采用 HPLC法检测转化液中α－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸浓度.HPLC色谱条件：采用Agilent1200高效液相色谱仪，色谱柱为 Agilent-C18柱（5μm，4.6×250 nm），检测波长210 nm，V（甲醇）∶V（醋酸铵缓冲液）＝20∶80（醋酸铵浓度20 mmol／L，pH 5.5），流速0.7 mL／min，室温检测，进样量10μL.

酶活力单位定义：在上述反应条件下每小时生成1μgα－乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）.

2 结果与讨论

2.1 碳源的影响

以初始发酵培养基组成为对照，分别以质量浓度为20 g／L的可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖为惟一碳源，考察其对产酶活力和菌体生长的影响.图1结果表明：采用葡萄糖为惟一碳源时酶活力较高，此时细胞干重（DCW）达2.74 g／L.故选择葡萄糖作为发酵培养基的碳源.继而考察葡萄糖质量浓度分别为10，15，20，25，30，35 g／L时对产酶的影响，确定较佳的葡萄糖质量浓度为15 g／L.

图1 不同种类碳源对酶活力和细胞生长的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on enzyme activity and cell growth

2.2 氮源的影响

分别考察了酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4和NH4Cl为单一氮源对产酶活力和菌体生长的影响，添加酵母粉、牛肉膏、蛋白胨的质量浓度均为20 g／L.为保证无机氮源和有机氮源相近的含氮量，（NH4）2SO4和 NH4Cl分别以9.4 g／L和7.6 g／L的质量浓度添加.图2结果表明：无机氮源中NH4Cl对菌体产酶更有利，有机氮源中酵母粉对菌体产酶更有利.NH4Cl一方面能够促进水解酶的形成，另一方面可能减轻过多的代谢产物对产酶的抑制作用.酵母粉能够提供更多产酶所需的维生素和微量元素，从而提高菌体产酶活力.采用有机氮源和无机氮源组成的复合氮源时的发酵结果将在后续的响应面实验中进一步优化.

图2 不同氮源对产酶活力和细胞生长的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity and cell growth

2.3 Plackett-Burman实验

通过Plackett-Burman实验设计，对葡萄糖质量浓度（X1），酵母粉质量浓度（X2），NH4Cl质量浓度 （X3），培 养 基 初 始 pH 值 （X4），KH2PO4＋K2HPO4质量浓度（X5），NaCl质量浓度 （X6）和MgSO4·7H2O质量浓度（X7）等7个因素进行考察，以确定影响产酶活力的主要因素，各因素分别取2个水平，响应值Y为酶活力.实验设计和结果见表1，各因素的水平与分析结果见表2.

表1 Plackett-Buman实验设计和响应值Table 1 Plackett-Buman experimential design and its responding value

表2 酶活主要影响因素的回归结果Table 2 The regression results of key factors on enzyme activity

从各因素影响的统计结果（表2）可知，酵母粉质量浓度（X2）和初始pH值（X4）的显著性系数（T）较高，且在95%置信区间内对产酶有显著影响，而其他因素的影响不大.模型的R2＝0.998，表明其拟合度较高.

2.4 响应面优化

根据Plackett-Burman实验结果，采用Draper／Lin实验设计进一步优化酵母粉质量浓度（X2）和培养基初始pH（X4），各因素分别取5个水平.实验设计和结果见表3.

表3 响应面优化中的变量及其各级中心复合旋转设计Table 3 Variables and their levels for the central composite rotatory design for response surface optimization

Draper／Lin中心组合实验共包括13个实验点，其中因子实验8个，中心点实验5个，所得结果见表4，以酶活为响应值的回归结果如表5所示，其中酵母粉质量浓度的一次项X2（p＝0.000 1）和二次项X22（p＝0.000 1）、培养基初始pH 的一次项X4（p＝0.001 3）和二次项X42（p＝0.000 1）均显著影响产酶活力，而酵母粉质量浓度和培养基初始pH的交互项X4X2（p＝0.466 6）对产酶活力的影响并不显著.二次回归模型的R2＝0.986 4，拟合度较好.以酶活力为响应值（Y1）的二次回归方程为

表4 Draper／Lin中心组合实验设计及结果Table 4 Draper／Lin central composite experimental design and the corresponding results

表5 酶活力回归分析结果Table 5 The regression analysis results for enzyme activity

根据模型预测，当酵母粉质量浓度和培养基初始pH分别为12.1 g／L和7.06时，酶活力达最大值，为1 013.9 U／mL.实验结果表明：由质量浓度为9.5 g／L的NH4Cl和12.1 g／L的酵母粉组成的复合氮源较单一氮源更加促进菌体的产酶活力.

采用优化得到的培养基组成进行验证实验.三次重复实验的平均酶活力为1 024.6 U／mL，较优化前提高了67%，且与响应面优化的模型预测值1 013.9 U／mL非常接近.

3 结 论

通过对耐酪氨酸冢村氏菌（Tsukamurellatyrosinosolvens）E105菌株发酵培养基中碳源和氮源的单因素试验考察，确定了较佳的碳源和氮源种类.Plackett-Burman实验结果表明：酵母粉质量浓度和培养基初始pH值对产酶影响显著.采用中心组合实验并结合响应面优化，得到最佳的培养基组成为：葡萄糖15 g／L，酵母粉12.1 g／L，NH4Cl 9.5 g／L，NaCl 0.6 g／L，MgSO4·7H2O 0.6 g／L，KH2PO41 g／L，K2HPO42 g／L，初始pH 为7.06.在优化的条件下，水解酶活力可达1 024.8 U／mL，较优化前提高了67%，该研究采用了一种生物催化制备左乙拉西坦手性中间体的新方法，具有较好的应用前景.

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Medium optimization forα-ethyl-2-O-1-pyrrolidineacetic acid ethyl ester hydrolase-producing strain using response surface methodology

YUAN Shuai，WANG Pu，HE Jun-yao
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Response surface methodology was applied to optimize medium constituents for enzymatic production of （S）-α-ethyl-2-O-1-pyrrolidineacetic acid from racemicα-ethyl-2-O-1-pyrrolidineacetic acid ethyl ester by a novelTsukamurellatyrosinosolvensE105.The influences of carbon and nitrogen resources were investigated.Then the Plackett-Burman design experiment was used to evaluate the effects of different components in the culture medium，yeast extract and initial pH were found to be the most important factors among seven tested variables affecting enzyme activity.Central composite design and response surface analysis were subsequently employed for further optimization，and the optimal concentration of yeast extract was 12.1 g／L，with the optimal initial pH of 7.06.Under the optimum conditions，the maximum enzyme activity of 1024.6 U／mL in the experiment was obtained，corresponding to an increase of 67%in comparison with the original medium components.Medium optimization forTsukamurella tyrosinosolvensE105 could increase obviously its hydrolyase-producing capability of enzymatic preparation of（S）-α-ethyl-2-O-1-pyrrolidineacetic acid.

α-ethyl-2-O-1-pyrrolidineacetic acid ethyl ester；Tsukamurellasp.；hydrolase；response surface optimization

TQ920.1

A

1006-4303（2011）05-0536-05

2010-04-29

浙江省制药重中之重学科开放基金资助项目（20100609）

袁 帅（1985—），男，江西新余人，硕士研究生，主要从事生物催化研究，E-mail：brandy101＠sina.com.通信作者：王普教授，E-mail：wangpu＠zjut.edu.cn.

（

刘 岩）