酶解－微波法提取黄芪多糖的工艺研究

董玲玲，黄 鑫，齐阳光，冯 海

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032）

酶解－微波法提取黄芪多糖的工艺研究

董玲玲，黄 鑫，齐阳光，冯 海

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032）

研究纤维素酶酶解－微波法提取黄芪多糖的新工艺.采用单因素分析与正交实验法，以黄芪多糖的提取率和质量分数为评价指标，考察酶料比、酶解时间、液固比、微波功率等工艺条件对多糖提取效果的影响.最佳工艺条件：酶料比57.6 U／g，酶解时间60 min，液固比10：1，微波功率480 W，提取时间8 min，重复提取1次，多糖提取率达到16.07%，多糖质量分数为88.40%，优于文献报道方法的提取效果.酶解－微波法具有耗时短、节约能源、提取率高、产物纯度较好等优点，是提取黄芪多糖的较理想方法.

黄芪多糖；酶解－微波法；正交设计

黄芪（RadixAstragali）又名膜荚黄芪、蒙古黄芪，为多年生草本豆科植物，其主要药用成分为黄芪多糖、黄芪总黄酮和黄芪总皂苷等.其中黄芪多糖（Astragaluspolysaccharides，APS）是黄芪主要生物活性成分，可作为免疫增强剂或调节剂，促进抗体形成，同时还有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗应激、抗氧化和降脂等作用［1］.传统的黄芪多糖提取方法有水煎煮法［2］及水回流提法［3］，提取率较低约在3.8%～9.78%之间.黄芪原料中纤维素的含量较高，是影响黄芪多糖溶出的主要因素之一，降低黄芪中的纤维素含量可以增加黄芪多糖的溶出.采用纤维素酶提取法［4］、碱醇提法［3，5］的提取率可达5.70%～19.15%之间，但是以上各种提取方法耗时长、能耗高、药材利用度较低.微波提取法利用微波穿透力强的特点，具有提取时间短、选择性好、加热效率高、可保护有效成分不被破坏等特点［6－7］，可提高植物多糖提取率，我们拟结合纤维素酶解和微波提取的优点，利用酶降解、破坏黄芪细胞壁，并采用微波促使多糖成分溶出，提高多糖的提取率，探索改善多糖纯度的方法并与文献报道方法进行比较.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄芪（购于杭州市九州大药房，产地甘肃，符合中华人民共和国药典2005版规定），纤维素酶（4 500 U／g，宁夏夏盛酶工程有限公司）.

葡萄糖（AR，广东光华化学有限公司），无水乙醇（AR，安徽安特生物化学有限公司），98%硫酸（AR，衢州巨化试剂有限公司），苯酚（AR，杭州双林化工试剂厂），所用水均为蒸馏水.

1.1.2 实验仪器

FZ102植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），752单光束紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），微波实验装置（最大功率800 W，2 450 MHz），RE52CS旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）.

1.2 实验方法

1.2.1 黄芪多糖含量的测定

黄芪多糖的测定方法主要有苯酚－硫酸比色法和蒽酮－硫酸比色法.本实验采用苯酚－硫酸法测定APS，其原理为多糖在浓硫酸的作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合生成橙黄色化合物，用比色法测定其含量［8］.

葡萄糖标准曲线的绘制：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg于100 mL容量瓶中加蒸馏水定容，摇匀，得100μg／mL葡萄糖标准溶液.精确移取标准溶液0.1，0.2，0.4，0.5，0.6 mL，分置于10 mL容量瓶中，各补加蒸馏水至2 mL，再分别加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，充分振摇2 min，静置30 min后，补充浓硫酸至刻度，以蒸馏水为空白对照，于波长490 nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程.

样品含量测定：将提取液定容至250 mL.取1 mL按上述方法操作，测定吸光度，依回归方程得黄芪多糖浓度.

1.2.2 黄芪多糖酶解－微波法提取工艺

黄芪烘干粉碎至20目→称取10 g黄芪粉，加入蒸馏水（调节pH值）→加纤维素酶于恒温干燥箱中酶解→微波浸提→过滤→取滤液浓缩→加5倍量95%乙醇沉淀→静置过夜→取沉淀→烘干得粗多糖.

1.2.3 黄芪多糖提取工艺影响因素的考察

据文献报道［4，9］，影响黄芪多糖提取工艺的因素主要包括物料粒度、液固比、酶料比、酶解温度、pH、微波提取时间及次数等.首先采用单因素考察法对酶解反应的温度、pH、微波提取时间及次数等影响因素进行确定，并在单因素试验的基础上采用正交设计优化的方法对结果影响较大的酶料比、酶处理时间、液固比、微波功率等4个因素进行考察.实验采用L9（34）正交实验表，其因素水平见表1.以多糖提取率与所得质量分数为考察指标，其表达式分别为

表1 酶解－微波提取APS因素水平表Table 1 Orthogonal experimental design for the extraction of Astragalus Polysaccharides by the enzymatic-microwave method

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

测得的葡萄糖质量浓度在1.0～6.0μg／mL范围内与吸光值呈良好线性关系，结果见图1.其回归方程为y＝0.112 9x＋0.014 9（R2＝0.998 1）.

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard cure for Glucose concentration determination

2.2 酶解的pH和温度条件对APS提取率的影响

pH和温度对酶的活性有重要影响，根据文献报道［3，10］，在pH 值为4.8，6.0，7.0的介质环境下分别在50℃和60℃条件下处理黄芪，测定多糖提取率.结果显示当pH＝6.0，温度60℃时，酶活较好.

图2 酶解pH和温度条件对黄芪多糖提取率的影响Fig.2 Effects of pH and temperature on the extraction rate of APS

2.3 微波提取时间对APS提取率的影响

微波提取时间的长短直接影响有效成分的溶出.在酶料比57.6 U／g、酶解30 min、微波功率480 W、液固比10∶1的条件下，考察不同微波提取时间对黄芪多糖提取率的影响.

由图3可知，微波提取时间为8 min时，多糖提取率达峰值，其后提取率降低.表明在微波提取8 min时，黄芪多糖已被基本提取完全，过长的提取时间反而会导致多糖的分解破坏.

图3 微波提取时间对黄芪多糖提取率的影响Fig.3 Effect of microwave radiation time on extraction rate of APS

2.4 微波提取次数对APS提取率的影响

实验考察了微波提取次数对APS提取效率的影响，结果见表2.由结果可知采用酶解－微波法提取2次，多糖已被基本提取完全，因此微波提取次数以2次为宜.

表2 微波提取次数对多糖提取率的影响Table 2 Effect of extraction times on the microwave extraction rate of APS

2.5 正交实验结果

由单因素实验可以确定酶解－微波提法酶解的条件为pH＝6.0，温度60℃，微波提取2次，每次8 min.由于酶料比、酶解时间、液固比、微波功率对酶解－微波法提取APS的效果影响较大，因此对这四个因素进行正交实验以获得最佳的工艺条件.其正交实验结果见表3.

表3 酶解－微波提取APS优化实验结果1）Table 3 Results of orthogonal experimental design for optimizing enzymatic-microwave extraction of APS

以提取率为评价指标时，各因素对提取效果的影响程度依次为C＞A＞B＞D，最佳工艺参数为酶料比57.6 U／g，酶解时间120 min，液固比15∶1，微波功率480 W；以提取物中多糖质量分数（纯度）为指标时，各因素对提取效果的影响程度依次为C＞B＞A＞D，最佳参数为酶料比57.6 U／g，酶解时间60 min，液固比10∶1，微波功率480 W.方差分析结果表明这些因素间差异不显著（P＞0.05）.以提取率为评价指标时的因素B和C中k2，k3差异较小.综合上述两项考察指标，选择最佳参数组合为酶料比57.6 U／g，酶解时间60 min，液固比10∶1，微波功率480 W.

2.6 验证实验

按照正交设计所得最佳工艺条件，即酶料比57.6 U／g，酶解时间60 min，液固比10∶1，微波功率480 W，进行验证实验.结果多糖提取率高达16.07%，多糖质量分数高达88.4%，两种指标均优于其他参数组合，证明提取工艺已得到很好的优化.由表4结果可知，酶解－微波法远优于其他方法，APS提取率分别是直接酶提法、微波提法、水回流提法的151%，117%，332%，APS的纯度分别为其他方法的138%，134%，235%.

表4 不同方法提取黄芪多糖效果的比较Table 4 Comparison of different extracting methods for APS extraction %

3 结 论

多糖属于极性大分子化合物，不同的提取条件和方法对多糖的提取率和纯度影响较大，传统的提取方法提取率较低，其原因在于黄芪多糖作为大分子化合物较难通过细胞壁，不易被提取.纤维素酶可特异性地降解植物细胞壁所含纤维素，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减少传质屏障对有效成分从胞内扩散的传质阻力，促进黄芪多糖的溶出，并通过微波的能量加速细胞质内多糖向外扩散的速度［11］.将酶解与微波提取二者结合可大大提高APS的提取效率，优化后的提取条件为酶料比57.6 U／g、酶解条件pH 6.0，60℃，酶解时间60 min、液固比10∶1、微波功率480 W，提取2次，每次8 min，提取率可达16.07%，多糖质量分数88.40%，大大优于相关文献报道.酶解－微波提取法作为一种较新的提取工艺具有耗时短、能耗低、对产物破坏性小、提取效率高等优点，可应用于其他动植物药有效成分的提取，值得进一步研究.

［1］熊成，王素敏，张然.植物多糖的一般研究［J］.中国现代药物应用，2008，2（18）：115-116.

［2］倪艳，苏强.黄芪多糖水煎提取工艺的优化试验研究［J］.中国中药杂志，1998，23（5）：284-286.

［3］李万玉，李安荣，徐晓玉，等.黄芪多糖的提取方法［J］.中国药业，2009，18（11）：87-88.

［4］闫巧娟，韩鲁佳，江正强.纤维素酶法提取黄芪多糖［J］.中草药，2005，36（12）：1804-1807.［5］田洛，宣依昉，范荣军，等.醇碱提取法提取黄芪多糖［J］.吉林大学学报：理学版，2006，44（4）：652-657.

［6］BAYRAMOGLU B，SAHIN S，SUMNU G.Solvent-free microwave extraction of essential oil from oregano［J］.Journal of Food Engineering，2008，88（4）：535-540.

［7］LIAO Zheng－gen，WANG Guang-fa，LIANG Xin-li.Optimization of microwave-assisted extraction of active components from Yuanhu Zhitong prescription［J］.Separation and Purification Technology，2008，63（2）：424-433.

［8］周文兰，童列波.苯酚－硫酸法测定康克胶囊中多糖含量［J］.时珍国医国药，2001，12（7）：505-506.

［9］许海燕，杨义芳，黄春跃.微波提取黄芪中多糖的工艺研究［J］.中草药，2008，39（10）：1496-1499.

［10］黄燕华，王国霞，周晔.不同纤维素酶的酶学性质比较研究［J］.饲料研究，2006（11）：47-49.

［11］余洪波，张晓昱.酶法在中药提取中的研究进展［J］.中成药，2005，27（5）：591-593.

Study on the enzymatic-microwave extraction of Astragalus polysaccharides

DONG Ling-ling，HUANG Xin，QI Yang－guang，FENG Hai
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

The microwave-assisted hydrolysis of cellulose was developed for the extraction ofAstragalusPolysaccharides（APS）.One-factor analysis and orthogonal experimental design were both applied to evaluate the extraction by the extraction rate and the purity of APS.The optimum enzymatic-microwave extraction condition was as follows：the liquid-to-solid ratio was 10∶1；the enzyme ratio was 57.6 U／g；the cellulase reaction time was 60 min before 8 min of microwave irradiation （480 W）.The extraction was repeated once.In these conditions，the maximum extraction rate could reach 16.07%and the purity could be up to 88.40%，which were much higher than those obtained from other extraction methods.The enzymatic-microwave assisted extraction is faster and more efficient with higher quality and therefore could be an ideal method for extracting the APS fromRadixAstragali.

Astragaluspolysaccharides；orthogonal experimental design；enzymatic-microwave extraction

R284.2

A

1006-4303（2011）05-0528-04

2010-04-06

浙江省重大科技专项基金资助项目（2007C12070）；浙江省科技计划项目（2008C23058）

董玲玲（1983—），女，浙江宁波人，硕士研究生，研究方向为天然产物提取研究，E-mail：lan.453＠163.com.通信作者：冯海副教授，E-mail：fenghai289289＠163.com.

（

刘 岩）