姜黄素对脑缺血再灌注模型大鼠的神经保护作用及其机制

徐 芳 魏桂荣

徐 芳,魏桂荣

湖北省襄阳市中心医院神经科,襄阳441021

脑缺血再灌注(Ischemia and Reperfusion,I/R)是脑组织损伤的重要机制,既往研究发现,脑缺血可诱导基质金属蛋白酶-9(Matrix Met-alloproteinase,MMP-9)表达,通过促进细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)降解和再灌注后血脑屏障开放,引起脑出血、脑水肿和白细胞浸润,最终导致神经功能损伤[1]。姜黄素是一种多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤效应[2]。本研究通过动态观察大鼠I/R及姜黄素处理对血脑屏障通透性和MMP-9表达的影响,探讨姜黄素的脑保护作用及可能机制,为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

姜黄素、伊文思蓝(EB)购自美国Sigma公司,兔抗鼠MMP-9单抗购自美国Santa Cruz公司,其余试剂为国产分析纯。

1.2 实验动物及分组处理

雄性SD大鼠,体重180～250g,购自华中科技大学统计医学院实验动物中心。随机分为3组(n均=6):假手术组、脑I/R模型组(模型组)和姜黄素组。模型组大鼠参照Longa等[3]报道的线栓法加以改进,建立局灶性脑I/R模型,栓线采用尼龙鱼线,直径0.26～0.28mm,长4.0cm。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰卧固定大鼠,分离并暴露左侧颈总及颈内、外动脉,尼龙鱼线从颈外动脉至颈内动脉插入大脑中动脉遇阻即止,进线长度18～20mm,栓塞成功的大鼠在缺血后2h拔除尼龙鱼线至颈外动脉残端内,恢复血流灌注。假手术组大鼠术后插入线栓深度为10mm,不形成栓塞。姜黄素组在缺血前1h腹腔注射姜黄素200mg/kg,随后每12h腹腔注射姜黄素60mg/kg,共5次。各组大鼠于再灌注后3h、24h、72h测定脑组织含水量和EB含量。之后断头取脑,迅速液氮保存备检MMP-9。

1.3 脑组织含水量测定

参照Xiao等[4]的方法进行。根据下列公式计算脑组织含水量:脑组织含水量=[(湿重-干重)/湿重]×100%。

1.4 脑组织EB含量测定

按照Ikede等[5]的方法进行脑组织EB含量测定。

1.5 MMP-9表达水平测定

各组大鼠断头取脑,取视交叉前后脑组织,匀浆,免疫印迹法检测MMP-9表达水平。

1.6 统计学处理

用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理,各组数据用均数±标准差(±s)表示,两组均数比较用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 姜黄素对脑I/R损伤后大鼠脑组织含水量的影响

模型组大鼠再灌注后各时间点脑组织含水量明显增加,与假手术组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),而姜黄素组脑组织含水量较模型组明显减少(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠脑组织含水量比较(%,±s,n均=6)

表1 各组大鼠脑组织含水量比较(%,±s,n均=6)

注:与假手术组比较,1)P＜0.01,与模型组比较,2)P＜0.01

时间 假手术组 模型组 姜黄素组3h 76.14±4.32 89.36±2.651) 82.45±2.142)24h 75.63±2.15 86.25±4.821) 80.35±3.522)72h 76.28±3.24 85.41±3.651) 79.32±1.972)

2.2 姜黄素对脑I/R损伤后大鼠脑组织EB含量的影响

模型组大鼠脑组织EB含量与假手术组比较明显增加(P＜0.01),而姜黄素组大鼠脑组织EB含量较模型组明显减少(P＜0.01)。见表2。

表2 各组大鼠脑组织EB含量比较(μg/g组织,±s,n均=6)

表2 各组大鼠脑组织EB含量比较(μg/g组织,±s,n均=6)

注:与假手术组比较,1)P＜0.01,与模型组比较,2)P＜0.01

时间 假手术组 模型组 姜黄素组3h 1.62±0.04 3.96±0.0551) 2.23±0.042)24h 1.58±0.04 3.75±0.041) 2.13±0.032)72h 1.62±0.03 3.59±0.051) 2.05±0.032)

2.3 姜黄素对脑I/R损伤后大鼠脑组织MMP-9表达的影响

假手术组未见MMP-9的表达,模型组脑组织MMP-9表达水平显著增高,而姜黄素组MMP-9表达水平明显低于相同时间点的模型组。见图1。

图1 姜黄素对大鼠脑I/R损伤后MMP-9表达的影响

3 讨 论

脑I/R损伤是脑血管病神经损伤的重要机制,缺血脑组织恢复血流后神经损伤反而加重,其机制非常复杂,主要涉及氧利用障碍、炎症反应、钙超载等,因此研究其机制并寻找针对性的干预方法具有非常重要的意义。血脑屏障通透性增加,一方面加重脑水肿,另一方面有利于炎症因子和炎性细胞通过血脑屏障,促进炎症反应和细胞凋亡[6]。因此,降低血脑屏障通透性进而减轻I/R损伤,是临床治疗目的之一。

EB是小分子指示剂,与血浆蛋白结合后,不能通过血脑屏障,只有当血脑屏障破坏时才进入脑组织,可作为评估血脑屏障损伤的定性指标。本文检测大鼠脑组织内EB含量时发现,I/R后3h至72h,模型组大鼠脑组织内EB含量明显高于假手术组,表明此时大鼠脑组织内血浆蛋白外渗,血脑屏障的通透性增加,且与脑组织含水量检测结果相吻合,提示再灌注损伤后血脑屏障损伤明显。而姜黄素组大鼠脑组织内EB含量和脑组织含水量低于模型组,表明姜黄素对脑缺血后血脑屏障具有保护作用。

既往研究表明,MMP-9在缺血脑损伤中起重要作用。缺血后脑组织MMP-9活性增加是缺血后血脑屏障损伤和加重缺血性脑损伤的重要机制之一[7,8]。本研究结果提示姜黄素的神经保护作用至少部分是通过抑制MMP-9的表达实现的。

综上所述,脑I/R损伤与MMP-9破坏血脑屏障关系密切,因此早期合理有效调节MMP-9,有望成为临床上防治血脑屏障损伤和血管源性脑水肿形成的有效方法。姜黄素可通过降低血脑屏障通透性、抑制MMP-9表达而发挥其对脑I/R损伤的保护作用,具有较好的临床应用前景。

1 Zhao BQ,Wang S,Kim HY,et al.Role of matrix metalloproteinases in delayed cortical responses after stroke.NaTMed,2006,12(4):441～445.

2 Awasthi H,Tota S,Hanif K,et al.Protectiveeffect of curcumin against intracerebral streptozotocin induced impairment in memory and cerebral blood flow.Life Sci,2010,86(3～4):87～ 94.

3 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats.Stroke,1998,29(8):671～678.

4 Xiao F,Zhang Z,Arnold TC,et al.Mild hy pothermia induced before cardiac arrest reduces brain edema formation in rats.Acad Emerg Med,2002,9(2):105～114.

5 Ikede Y,Wang M,Nakazawa S.Simple quantitative evaluation of blood brain barrier disruption in vasogenic brain edama.Acta Neurochir,1994,60(Suppl):119～120.

6 Asahi M,Wang XY,Mori T,et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-outon the proteoly sis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia.J Neurosci,2001,21(19):7 724～7 732.

7 Kamada H,Yu F,Nito C,et al.Influence of hyperglycemia on oxidative stress and matrix metalloproteinase-9 activation after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats:relation to bloodbrain barrier dysfunction.Stroke,2007,38(3):1 044～1 049.

8 Barr TL,Latour LL,Lee KY,et al.Blood-brain barrier disruption in humans isindependently associated with increased matrix metalloproteinase-9.Stroke,2010,41(3):e123～128.