用统计学方法优化柠檬苦素闪式提取工艺*

刘静 刘灿 荣永海 荣龙

(北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京100191)

柠檬苦素是存在于芸香科和楝科植物中的三萜类苷元成分，尤其在柑桔属植物种子中含量丰富［1］.药理研究表明，柠檬苦素具有抗病毒、抗癌、降低胆固醇等多种生理活性［2-3］.目前关于柠檬苦素的提取方法主要有索氏提取法［3-5］、超声波辅助提取法［6］、超临界 CO2提取法［7］及水助溶剂提取法［8］等.经典的索氏提取法耗时较长，一般需要4～8h;超声波辅助和超临界CO2法作为新兴的提取技术能显著缩短提取时间，但由于设备昂贵、操作条件不易控制而使其工业化应用受到限制;水助溶剂法虽然不使用有机溶剂，但引入高浓度的助溶剂(Na-Sal或Na-CuS)可能会影响后续的分离过程.

天然产物有效成分提取工艺的优化对提高提取效率和产物收率起着重要作用，目前提取工艺的统计学实验设计方法主要有正交实验设计法、均匀实验设计法和响应曲面法.经典的正交实验设计在工艺优化中已广泛应用;均匀实验设计是由方开泰教授和数学家王元在1978年共同提出，其应用在国内外均有报道［9-10］;响应曲面法是通过图形技术将响应(如提取率)与因素的函数关系显示出来，现已广泛应用于工艺优化中.

为了开发一种快速高效的提取方法，本研究将闪式提取技术应用于柠檬苦素的提取过程中，比较了3种统计学实验设计方法优化柠檬苦素提取条件的结果，为统计学方法在天然产物有效成分提取工艺优化上的应用提供参考.

1 材料和仪器

广州新会柑脱脂后的种子，广东省江门市浩伦生态农业有限公司提供，种子含油量41.5%(质量分数);柠檬苦素标准品，美国Sigma公司生产;乙腈为色谱纯试剂，北京百灵威科技有限公司生产;其他为分析纯试剂.

JHBE-50型闪式提取器，河南金鼐科技发展有限公司生产;Waters高效液相色谱仪(600E双泵，2478型紫外检测器，Empower色谱工作站)，美国Waters公司生产;

2 柠檬苦素提取分离及检测方法

2.1 闪式提取及分离柠檬苦素

准确称取干燥种子粉末10.0 g，置于闪式提取装置容器中，根据实验设计的具体要求，加入60% ～80%(体积分数)的乙醇溶液 100～300 mL，在3000～5000 r/min转速下提取1 min，提取两次.将两次提取液混合，减压浓缩回收乙醇至干，得到的残渣加少量石油醚去除残余油脂，再将残渣用二氯甲烷萃取，得到的萃取液挥发至1～3mL，再加入3倍体积的异丙醇，置于4℃条件下结晶，析出的晶体用异丙醇洗涤，然后加入20 mmol/L的NaOH溶液快速洗涤，最后干燥得到的白色晶体即为柠檬苦素.

2.2 柠檬苦素的液相色谱分析

2.2.1 色谱条件

Waters Sunfire C18色谱柱 (150 mm×4.6 mm，5μm);流动相为45%(体积分数)的乙腈溶液;流速为1mL/min;检测波长为210nm;进样量为20μL;柱温为室温.

2.2.2 测定方法

将柠檬苦素标准品用乙腈溶解并用流动相稀释至不同浓度，以峰面积Y、标准品质量浓度X(mg/mL)进行线性回归，得到柠檬苦素的标准曲线方程为Y=16671X+35617(r=0.9972)，柠檬苦素标准品在质量浓度175～300μg/mL范围内线性关系良好.将2.1节中获得的柠檬苦素样品加入45%的乙腈溶解，配成质量浓度在线性范围内的溶液，通过标准曲线中的峰面积计算出样品收率(mg/g).

3 结果与讨论

3.1 提取工艺的优化设计

本研究选取影响闪式提取工艺的3个因素，各因素及水平变化范围如下:乙醇浓度(体积分数)60% ～80%，液固比10～30mL/g，闪提转速3000～5000r/min;3个因素依次记为因素A、B、C.根据不同设计方法来选取水平，按照正交实验设计法、均匀实验设计法和响应曲面法进行实验.

3.1.1 正交实验设计法

正交实验设计具有“均匀分散、整齐可比”的特点，可定量的给出因素的主次关系，从而分析各因素对指标的影响大小及变化规律.本研究按照正交表L9(34)进行三因素三水平的正交实验，各因素水平如表1所示，具体实验设计及结果如表2所示，方差分析结果见表3.

由表2直观分析极差R可以看出，各因素对柠檬苦素收率的影响权重依次为A＞B＞C.比较k值得出最佳的提取条件是A2B3C2，即乙醇浓度70%、液固比30mL/g，闪提转速4000r/min.由表3的方差分析结果可以看出，A和B两个因素对实验结果有显著性影响(P＜0.05)，C因素(P＞0.1)无显著性影响.对最佳提取条件进行验证实验，得到柠檬苦素收率为(6.48±0.01)mg/g.

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

表2 正交实验设计及结果Table 2 Optimization of experimental conditions for the extraction of limonin by orthogonal design

表3 正交实验方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of orthogonal design

3.1.2 均匀实验设计法

均匀实验设计与正交实验设计的特点不同，它只考虑实验点在实验范围内的“均匀分散”，不考虑“整齐可比”，因此能用较少的实验点获得最多的信息.尤其在实验水平变化范围较大时，可大大减少实验次数.如三因素九水平实验，正交实验设计需要243次实验，而均匀实验设计只需要9次实验即可完成;若设计三因素三水平实验，均匀设计只需要3次实验即可完成，但这样实验次数太少，结果误差太大，并且对结果难以进行回归分析.所以本研究选择与正交实验设计相同的实验次数，按照均匀表U9(96)进行三因素九水平的均匀实验，各因素水平如表4所示，具体实验设计及结果如表5所示，回归分析结果见表6.

表4 均匀实验因素水平表Table 4 Factors and levels of uniform design

表5 均匀实验设计及结果Table 5 Optimization of experimental conditions for the extraction of limonin by uniform design

表6 均匀实验设计回归分析Table 6 Regression analysis of uniform design

对表5中数据进行多元二次曲线回归，方程简化后为Y=-51.391 9+1.778 1A-0.494 1B-0.0140A2-0.0022B2+0.0089AB，方程相关系数r2为0.9628，说明方程拟合较好.由表6可以看出，F值远大于Sig.F值，并且Sig.F值＜0.05，说明回归方程可信且较显著.方程中去掉了因素C即闪提转速的影响，说明该因素在实验范围内对柠檬苦素收率Y的影响很小，这与正交实验方差分析结果一致.对回归方程各项系数进行t检验，可知各因素对收率的影响程度依次为A＞B＞C.最佳的提取条件为乙醇浓度72.5%、液固比22.5 mL/g、闪提转速4250r/min，该条件下进行验证实验得到柠檬苦素收率为(6.59±0.01)mg/g.

3.1.3 响应曲面法

响应曲面法以建立的连续变量曲面模型对影响提取过程的因素及其交互作用进行评价，来确定最佳水平范围.本研究采用Box-Behnken Design对柠檬苦素的闪提工艺进行优化，选择乙醇浓度、液固比和闪提转速作为自变量，每个自变量的低、中、高实验水平编码分别为-1、0、1.各因素水平编码如表7所示，具体实验设计及结果如表8所示，方差分析结果见表9.

表7 响应曲面法实验因素水平编码表Table 7 Level and code of variables chosen for Box-Behnken design

表8 响应曲面法实验设计及结果Table 8 Optimization of experimental conditions for extraction of limonin by Box-Behnken Design

表9 响应曲面法实验结果方差分析Table 9 Analysis of variance(ANOVA)of Box-Behnken design

对表8的数据进行二次回归，得到回归方程为Y=6.37+0.23A+0.68B+0.24C+0.13AB-0.14AC-0.27BC-1.05A2-0.40B2-0.17C2，可以看出各因素对柠檬苦素收率Y的影响程度依次为A＞B＞C.由表9方差分析可知，该模型的P＜0.01，说明方程非常显著，而失拟项的P＞0.05，表明其相对于纯误差而言为不显著.方程相关系数r2为0.998，说明方程拟合较好，各因素与收率呈现良好的相关性.

三维响应曲面图反映了各因素相互作用及对柠檬苦素收率的影响.3个因素对柠檬苦素收率影响的响应曲面图如图1所示.由图1可见，乙醇浓度对柠檬苦素收率的影响呈现抛物线趋势，当浓度为72%左右时收率达到最大值，此后进一步增加乙醇浓度，收率降低，这种变化可能是由于种子中的某些蛋白成分在高浓度醇下变性而影响提取效果;图1中收率随着液固比的增加而增加，当达到29 mL/g左右时收率不再增加，液固比进一步提高后收率基本不变;闪提转速对收率的影响很小，在4 000～4500r/min时收率变化很小，考虑低转速能够节约能源，所以选择闪提转速在4000r/min左右.

对数据二次回归拟合计算后得出最佳工艺条件为乙醇浓度71.7%、液固比28.8 mL/g、闪提转速3953r/min，通过响应曲面法预测，在最佳条件下柠檬苦素收率可达6.68mg/g，在该条件下进行验证实验，得到柠檬苦素收率为(6.65±0.01)mg/g.

3.2 3种统计学方法优化提取工艺的比较

由前文结果可以看出，3种优化方法得到的最佳提取条件和该条件下得到的柠檬苦素收率结果相近，其中响应曲面法优化得到的柠檬苦素收率最高，达(6.65±0.01)mg/g;可见这3种方法均有较强的优化能力，在应用方面各有其特点.

图1 3个因素对柠檬苦素收率影响的响应曲面图Fig.1 Response surface plots for the effects of ethanol concentration，solvent/solid ratio and rotational speed on limonin yield

正交实验设计简单，数据处理方便，通过直观分析即可得出各因素对收率的影响权重，但正交实验设计只能对各因素单独进行考察，对因素间的相互作用很难评价，并且对收率结果无预测能力，这使其应用有局限性.当实验因素范围变化较大，需要较多水平时，均匀实验设计则突显其优势，可极大地减少实验次数，但均匀实验设计结果分析比较复杂，各因素对收率的影响需通过回归计算进行分析，由于实验次数过少，回归方程对各因素间的非线性关系的提取能力较差，故预测能力太弱.响应曲面法建立的是复杂的多维空间曲面，比较接近实际情况，由于响应曲面法实验点安排合理，在保证实验精度的前提下大大提高了效率，而且预测能力较强，但实验结果分析同样需要先对数据进行拟合，才能判断各因素对柠檬苦素收率的影响程度，并且实验次数相对前两种方法较多，当考察因素多、实验费用高时，该法就很难广泛应用.所以针对不同的提取工艺来选取不同的实验优化方法是十分必要的.

3.3 柠檬苦素的测定结果与讨论

柠檬苦素纯度通过高效液相色谱法测定，柠檬苦素标准品和样品色谱图如图2所示.

图2 柠檬苦素标准品和样品色谱图Fig.2 HPLC spectra of limonin and the sample from orange seeds

由图2可见，柠檬苦素样品的保留时间为7.7min，与标准品一致.样品纯度按下式计算:

其中:P为柠檬苦素纯度，%;ρ为样品溶液质量浓度，g/mL;V为样品溶液体积，mL;m为样品质量，g.

通过该公式计算得到柠檬苦素样品纯度为95%.

本研究在柠檬苦素的提取方面采用了先进的闪式提取技术，该技术依靠高速机械剪切力和超速动态分子渗滤作用，在室温及溶剂存在的条件下，将药材破碎至细微颗粒，并使有效成分迅速达到组织内外平衡［11］.几种不同提取方法的提取时间和柠檬苦素收率如表10所示.

由表 10 可见，与其他提取方法相比［5，7-8］，闪式提取法得到了高纯度高收率的柠檬苦素，虽然超临界CO2法得到的收率与其相当，但闪式提取时间大大降低，所以该技术在柠檬苦素提取方面具有效率高、耗时少、能耗低的特点，可进一步开发应用于工业化生产中.

表10 不同提取方法的提取时间和柠檬苦素收率Table 10 Extraction time and limonin yields with different extraction methods

4 结语

通过3种统计学方法(正交实验设计法、均匀实验设计法和响应曲面法)分别优化了闪式提取广州新会柑种子中柠檬苦素的提取工艺，并通过结晶法对产物进行分离纯化，采用高效液相色谱法对产物进行测定，得到柠檬苦素纯度为95%;其中响应曲面法最佳提取条件(乙醇浓度71.7%，液固比28.8mL/g，闪提转速3953 r/min)下，柠檬苦素收率达(6.65±0.01)mg/g，略高于其他两种优化方法结果.总的来看，这3种优化方法结果相近，结论基本一致.本研究对闪式提取技术的开发和优化提取工艺的方法具有重要的参考价值.

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