柑橘籽中柠檬苦素及类似物的生物活性研究进展

晏敏，周宇，贺肖寒，梅明鑫，董全

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

我国是世界上柑橘第一生产大国， 2015年全国柑橘总产量高达3.6×107t，并且呈逐年递增趋势，但柑橘加工利用程度却远远不够，许多柑橘资源还未能得到充分地开发利用。柑橘籽具有显著的抗糖尿病、低胆固醇血症和降血脂活性[1]，在临床领域主要是用于治疗急性乳腺炎、肝癌和乳腺增生等疾病[2]。其有效组分主要是柠檬苦素类化合物。柠檬苦素类化合物是一类具有呋喃环并且高度氧化的四环三萜类次生代谢产物[3]，该类物质具有抗肿瘤[4]、镇痛消炎[5]、抗焦虑镇静、杀虫和抗氧化等生物活性[6]。人们已经发现了300多种柠檬苦素类化合物[7]，在柑橘类果实的核、囊衣和内果皮等部位含量丰富[8]，柑橘籽中柠檬苦素含量高达3 200.0 mg/kg[9]。柠檬苦素类化合物除了用作药物以外，还可以作为保健品和天然食品添加剂广泛应用于食品行业[10]，也可以用作天然杀虫剂以及动物饲料添加剂。本文就近年来国内外对柑橘籽中柠檬苦素及类似物的生物活性研究进展进行了评述，并对其发展趋势进行了展望。

1 柑橘籽中柠檬苦素类化合物的种类及结构及合成途径

1.1 柠檬苦素类化合物的种类及结构

柠檬苦素类化合物(limonoids)是一类含有4,4,8-三甲基-17-呋喃基甾体基本骨架结构的化合物[7, 11]。柠檬苦素类化合物在芸香科植物中主要分为苷元型柠檬苦素类、糖苷型柠檬苦素类和降解型柠檬苦素类[12]。目前从芸香科中分离得到了71个柠檬苦素苷元类化合物，21个柠檬苦素糖苷型类化合物，13个柠檬苦素降解型类化合物[13]。柠檬苦素苷元类化合物有5种类型，完整四环骨架型(如7-de ac-etylazadirone)，A环开裂型(如7-deacetylproceranone和kihadalactoneA)，A、D环开裂型(如atalantolide和obacunoic acid)，B、D环开裂型(如hortiolideA和hortiolideB)和A、B、D环开裂型(如deoxylimonic acid)(图1)。

图1 柠檬苦素苷元类化合物Fig.1 Limonin aglycones

图2 柠檬苦素糖苷类化合物Fig.2 Limonin glycosides

柠檬苦素糖苷类化合物是由柠檬苦素苷元在17位和一分子葡萄糖以糖苷键的形式结合而成的，如methyldeacetylnomilinate17-O-β-D-Glc、alamin17-O-β-D-Glc、obacunone17-O-β-D-Glc和nomilin17-O-β-D-Glc等(图2)。柠檬苦素降解型类化合物是由柠檬苦素类化合物失去A、B环而形成的一类化合物，如calodendrolide、dictamdiolA、calodendrolide、dictamdiolB和dasycarpol等(图3)[14]。

图3 柠檬苦素降解型类化合物Fig.3 Degradation of limonoids

柠檬苦素(limonin)又称吴茱萸内酯，其分子式为C26H30O8，分子质量为470.53[15]。柠檬苦素类化合物含有C-17与D-环连接的呋喃环，在C-3，C-4，C-7，C-16，C-17位均有含氧官能团，除脱氧柠檬苦素外，C-14、C-15位上均有氧桥环[16]。它具有椅子配合的环己烷环(D)，环己酮和扭船构象的两个内酯环(D，A和E)，呋喃(B)和环氧化物。此外，还存在具有平坦构象的第二呋喃环(F)作为取代基[17]。柠檬苦素类化合物的存在形式有苷元和配糖体2种，苷元不溶于水且是引起后苦味的主要原因，而糖苷具有良好的水溶性且几乎没有苦味，在强酸和强碱条件下能发生水解，生成相应的苷元和葡萄糖[18]。主要的柠檬苦素类似物苷元有诺米林和奥巴叩酮，常见的柠檬苦素类似物配糖体有奥巴叩酮17-β-D-吡喃葡萄糖苷、柠檬苦素17-β-D-吡喃葡萄糖苷和诺米林17-D-β-吡喃葡萄糖苷等[16]。从柑橘属植物中得到了38种柠檬苦素糖苷配基和20种柠檬苦素配糖体[19]，如存在于柑橘籽中的柠檬苦素、异柠檬苦酸(isolimonexic acid)、奥巴叩酮(obacunone)、诺米林(nomilin)、宜昌根(ichangin)、脱乙酰诺米林(dealcetrylnomilin)、诺米林酸(nomilin acid)、脱乙酰诺米林酸(dealcetrylnomilin acid)等。其中部分物质的结构见图4。

图4 柑橘籽中的柠檬苦素及其类似物Fig.4 Limonin and its analogues in citrus seeds

1.2 柠檬苦素的生物合成途径

图5 柑橘籽中柠檬苦素生物合成途径Fig.5 Biosynthesis of limonin in citrus seed

柠檬苦素类化合物在无损坏的果实中以无苦味的柠檬苦素A-环内酯(limonoate A-ring lactone，LARL) 形式存在，果实受到损伤或榨汁后，在酸性条件下，经过柠檬苦素D-环内酯水解酶(limoninD-ring lactone hydrolase，LDRLase)的催化作用，LARL迅速转化为具有强烈苦味的柠檬苦素[20]。生物合成柠檬苦素的前体物质是乙酰辅酶A，其通过三步生物合成途径生成甲羟戊酸。再经过3个步骤得到二磷酸异戊酯(IPP)或其异构体二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)。3个C5单位的IPP / DMAPP提供碳以构成法呢基二磷酸酯(FPP)的支架，后者的2个C15单元最终得到角鲨烯(SQ)，是最接近柑橘类柠檬苦素类化合物的氢化物[15, 21-22]。由角鲨烯(SQ)合成诺米林后可以经过4条途径得到柠檬苦素类化合物，这4条途径分别是柠檬苦素类群合成途径、卡拉敏群合成途径、宜昌根辛类群合成途径和醋酸酯类群合成途径[23]。柑橘籽中柠檬苦素是由角鲨烯(SQ)形成诺米林再经柠檬苦素类群合成途径得到奥巴叩酮，奥巴叩酸，最终合成柠檬苦素[7, 24]，见图5。

2 柠檬苦素类化合物的生物活性

2.1 抗癌

柑橘籽中的某些化合物具有较强的抗癌活性，对淋巴癌、乳腺癌、口腔癌、肾癌及胃癌等多种癌细胞有显著的抑制作用。其主要的生物活性成分是柠檬苦素类化合物，它可以通过清除自由基、激发谷胱甘肽转移酶的活性、抑制致癌化学物质的活性及抑制肿瘤细胞的增殖来防治肿瘤。柠檬苦素类化合物含有的呋喃环是其具有抗癌活性的关键结构[25]。

RAHMAN等[26]通过MTT法检测了柠檬苦素对各种人类癌细胞的抗癌作用。结果表明，柠檬苦素是通过促进凋亡相关蛋白的表达来使细胞凋亡，能显著地抑制癌细胞的生长，其效果与柠檬苦素剂量有关。董秋月[27]从干燥的枳壳中得到了一种结构新颖的柠檬苦素类化合物(I)(如图6)。化合物(I)经体外试验证明能够抑制肾癌细胞增殖，并且抑制效果与浓度及时间有关。向羽[12]从柚类果实中提取纯化的柠檬苦素和诺米林具有一定的抑制肿瘤细胞増殖的作用，诺米林[IC50为(63.3±7.6) mg/mL]能抑制白血病细胞增殖，且与其含量呈正相关。还有其他抗癌类型和相关活性物质如表1所示。

图6 结构新颖的柠檬苦素类化合物(1)Fig.6 Structure of the new limonoids(1)

序号抗癌类型活性物质作用途径1胰腺癌柠檬苦素，柠檬酸，柠檬酸葡萄糖苷抑制Panc⁃28细胞，IC50值在18～42μmol/L范围内，有利于蛋白的细胞凋亡按照ILNANLNANSGNLimoninNLG的顺序进行表达[28]2雌激素反应性乳腺癌(MCF⁃7)柠檬苦素，诺米尼酮，奥巴酮，柠檬苦酸，异柠檬苦酸胱天蛋白酶⁃7依赖途径[29-30]3L5178Y淋巴瘤细胞柠檬苦素高细胞毒活性(IC50=8．5μg/mL)[31]4A毒素B1或抗DEN诱导的肝癌柠檬苦素抑制LPO和氧化应激介导的自由基产生和调节抗氧化剂防御机制[32]5结肠癌柠檬苦素抑制β⁃连环蛋白的转录活性，抑制肠息肉形成[33]6胃癌MKN45toonaciliatinA诱导移植瘤组织中caspase⁃3蛋白表达增加，抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡[34]

2.2 抗病毒

柠檬苦素具有较好的抗病毒活性，如YAN等[35]使用2种方法对柠檬苦素对烟草花叶病毒(TMV)复制的抑制活性进行测试，第一种方法是通过半叶法在抗烟草花叶病毒N.glutinosa染色体片段中测定化合物的感染抑制活性，另外一种方法是使用Western印迹分析来验证抑制烟草花叶病毒衣壳蛋白(TMV-CP)的积累。结果显示，柠檬苦素对TMV具有较强的抑制活性，并且可以增加宿主植物对TMV感染的抗性。BALESTRIERI等[36]研究发现，柠檬苦素对人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-1)和HIV-1RT活性也有抑制作用。但是，柠檬苦素具有抗病毒特性的相关机理还不是很清楚，有待进一步研究。

2.3 防治骨质疏松症

LEE等[37]研究表明,柠檬苦素刺激碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化，并通过细胞外信号调节激酶(ERK)和成骨细胞MC3T3-E1细胞中p38信号传导来增强成骨细胞分化标记基因的表达。在动物中，柠檬苦素能抑制大鼠卵巢切除术(OVX)诱导的体重增加，影响小梁骨结构和生物化学性质，提高骨矿物质的密度和含量。柠檬苦素对骨形成具有良好的作用，可用于研发具有防治骨质疏松症作用的膳食补充剂。

2.4 镇痛消炎

有研究者证实了柠檬苦素类化合物具有较强的镇痛消炎的生物活性。如YANG等[38]研究表明,柠檬苦素类化合物3c(图7)显示出很强的镇痛和抗炎活性，其镇痛活性比阿司匹林更大，其抗炎活性强于萘普生。李敬芳等[39]采用超声提取陈皮中的柠檬苦素，并分析了柠檬苦素对小鼠植入棉球致肉芽肿和小鼠扭体产生的抑制作用。结果显示，从陈皮中提取出的柠檬苦素对小鼠植入棉球致肉芽肿和扭体反应有显著的抑制作用，表明了柠檬苦素具有较强的抗炎镇痛作用。柠檬苦素类化合物作为一种天然药物成分，将会在医药行业有广阔的应用前景。

图7 柠檬苦素类化合物3cFig.7 Limonin compounds 3c

2.5 护肝作用

在化学诱导肝损伤的情况下，已经证实柠檬苦素具有抗炎症和抗氧化特性。柠檬苦素可以通过降低乳酸脱氢酶，降低氧化应激，降低和固缩肝细胞变性来改善实验诱导肝缺血再灌注的有害作用[40]。试验中大鼠在D-半乳糖胺(D-Gal N)注射前口服柠檬苦素，其肝脏损伤和肝炎，氧化应激和Toll样受体4(TLR-4)的表达显著减弱。柠檬苦素(100 mg/kg)比胆红素的效果更好。柠檬苦素低剂量(50 mg/kg)比高剂量(100 mg/kg)表现出更好的抗氧化应激和肝脏结构损伤。柠檬苦素通过减轻炎症和减少氧化应激，对炎症和组织损伤相关的肝毒性发挥保护作用。

KELLEY等[41]在超重/肥胖个体的交叉，安慰剂对照，双盲研究中确定了柑橘类柠檬苦素对慢性炎症疾病如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、糖尿病和癌症的循环生物标志物的影响。柑橘类柠檬苦素能显著降低肝脏蛋白质的浓度：γ-谷氨酰转移酶，丙氨酸转氨酶，碱性磷酸酶和补体C3。由于在代谢综合征、NAFLD、糖尿病、慢性肾脏疾病和肝癌中肝脏酶会升高，柑橘类柠檬苦素可用于预防和治疗此类疾病。HAN等[42]使用液相色谱-串联质谱法检测了柠檬苦素对人类肝脏微粒体中主要的CYP同工酶活性的体外抑制作用。并且观察到柠檬苦素对CYP3A4具有强烈抑制作用，IC50值为6.20l mol/L。

2.6 杀虫活性

柠檬苦素类化合物能抑制昆虫产卵的特性，如ERAKY等[43]通过给携带有吸血虫的小鼠灌胃不同浓度的柠檬苦素来评估其治疗效果。结果表明，在小鼠感染后，给予剂量为50或100 mg/kg的柠檬苦素可以明显减少蠕虫数量，小鼠肠组织中蛋载量分别下降了46.67%和56.1%，与卵死亡水平升高有关。柠檬苦素和诺米林还具杀虫的活性，BILAL等[44]用含有柠檬苦素和诺米林的柑橘油对白纹伊蚊进行处理，结果表明，柠檬苦素和诺米林的杀虫效果都比较好，其IC50为297×10-6，死亡率为97%。因此，柠檬苦素类化合物可以作为一种天然的生物杀虫剂应用于农业中，它不仅杀虫效果好，而且安全无污染。

2.7 降低食欲和抗肥胖

最新的研究表明，柠檬苦素具有降低食欲和抗肥胖的作用，能够明显降低机体的能量摄入。YOON等[45]研究了加味剂刺激OST途径中主要的第二信使Ca2+和cAMP增加，在非神经元3T3-L1细胞中对柠檬苦素进行预处理。柠檬苦素能显著降低丁香酚诱导的Ca2+和cAMP水平和上调环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)和cAMP依赖蛋白激酶(PKA)的磷酸化。它们能通过调节Ca2+和cAMP水平和CREB的磷酸化来抑制非神经元细胞中的OST途径，从而降低食欲。徐铁山等[46]研究了柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中核纤层蛋白基因表达的影响，结果显示，在培养基中添加柠檬苦素能够对牛前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的程度起到显著的抑制作用。LMNA 基因在牛前体脂肪细胞中的表达水平比较高，添加柠檬苦素后能够降低LMNA基因表达水平。从而表明了柠檬苦素能够抑制脂肪的形成。

2.8 其他方面的生物活性

柠檬苦素类化合物还可以防治动脉粥样硬化，SAH等[1]用石油醚从CitrusmedicaLinn种子中提取柠檬苦素类物质，并以大白鼠为受体，研究表明，柠檬苦素类物质能明显降低大鼠体内血清胆固醇、血清甘油三酯的含量，增加高密度脂蛋白胆固醇(HDL)含量，这可以降低动脉粥样硬化的发生。诺米林及其他柠檬苦素类似物具有抗氧化活性[47-48]。李林子等[49]研究表明，柠檬苦素可以使衰老模型小鼠的血清及其脑组织中脂褐素、丙二醛水平明显降低，并且还能提高血清及脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活力及脑组织中总抗氧化的能力。此外，柠檬苦素类化合物还具有抑菌等其他生物活性。

3 柠檬苦素类化合物的应用

3.1 在食品中的应用

柠檬苦素类化合物具有抗癌、降低胆固醇和抗肿瘤等活性，且它的配糖体水溶性好且无苦味，因此可以直接将其作为功能性食品添加剂加以利用。柠檬苦素类化合物的苷元水溶性差且能产生苦味，经过合理的包埋处理后也可以用做功能性食品添加剂，其用途更加广泛。在骨代谢中，柠檬苦素对骨形成具有良好的作用，可以作为防治骨质疏松症的功能性食物成分和膳食补充剂。柠檬苦素和诺米林具有较高的抗氧化生物活性，研究发现柠檬苦素与VC的抗氧化能力相当，可以将其开发成天然抗氧化剂既营养又安全。为了能够延长食品的保质期，防腐剂的使用是不可或缺的，利用柠檬苦素及其类似物的抗菌活性，可以将其作为一种天然的防腐剂运用在食品工业中。

3.2 医药中的应用

柠檬苦素能够通过保护神经细胞，预防因衰老而产生的机体氧化损伤，来改善神经退行性病变及认知功能的下降，可以开发防衰老、提高学习记忆能力的植物源性药物；柠檬苦素能通过抗炎、抗氧化来保护肝脏损伤，因此可用于研制治疗肝脏疾病的天然药物。通过体外实验和动物实验已经证实了柠檬苦素类化合物具有防癌抑癌的生物活性，这将为开发食物来源的新型高效低毒的抗癌药物奠定了基础。此外，柠檬苦素具有防治骨质疏松症的生物活性，借此可以开发相关的药品用来预防和治疗骨质疏松症。

3.3 在畜牧业和农业中的应用

柠檬苦素类化合物在畜牧业中起着驱虫保健、疾病防治、增强动物解毒能力、抗应激、饲料保藏剂以及瘤胃调控作用。柠檬苦素及其类似物具有的多种优良生物活性更加有利于动物健康，还可以将其开发成饲料添加剂添加到家兽家禽饲料中。这将有利于资源的有效综合利用，减少环境污染，提高畜产品品质。由于柠檬苦素及其类似物还具有昆虫拒食和杀虫的作用，可将其开发成一种新型绿色杀虫剂和农药，这不仅可以用于防治多种农作物害虫，还可以防治不同植物病原菌的侵害。既能减少对环境的污染，又可以减少有毒杀虫剂或农药对人类和动物的伤害。

4 展望

柠檬苦素及类似物具有抗癌、抗病毒、抗肿瘤、镇痛消炎和抗氧化等生物活性，基于此，可以将其开发成功能性产品进行应用，这将会给人类带来较大的利益。但是有关柠檬苦素类化合物生物活性的相关机制，其化学结构与生物活性之间的联系，不同功能基团相对应的作用等方面的研究还不够深入，给开发利用带来不便，因此还需要进一步的研究。比如，柠檬苦素类化合物可以作为潜在的抗癌剂，它的机理主要是从通过信号传递通路的调控、线粒体途径机制、凋亡基因表达等多条诱导癌细胞凋亡的途径来进行探讨。但是，这些诱导途径相互渗透、相互影响，因此需要更为深入地研究复杂的抗肿瘤机制。此外，柠檬苦素类化合物的抗氧化性和抑菌性与分子结构的关系及作用机理目前尚不清楚，需进一步研究。如果能够合理高效地利用柠檬苦素类化合物，将会带来巨大的经济效益。但是，柠檬苦素类化合物的生产还没有进入产业化、规模化，其应用还没有商业化。因此，需要加强柠檬苦素类化合物在食品、医药、畜牧业和农业等领域中的开发应用，发挥其应有的价值来造福全人类。

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