黑曲霉发酵粗酶液去除柚汁中柠檬苦素研究

肖仔君，陆伟东，张吉刚，林丽芳

（1.韶关学院 英东食品学院，广东 韶关 512005；2.韶关学院 化学与土木工程学院，广东 韶关 512005；3.丽珠集团利民制药厂，广东 韶关 512028；4.韶关市紫背桃源生态科技有限公司，广东 韶关 512000）

沙田柚属芸香科柑橘属乔木柚树的果实，含有较多营养成分［1］.目前沙田柚果汁加工工艺成熟，但柚汁由于加工后苦味明显，仍处在脱苦初步研究阶段，常见的脱苦方法主要有包埋法、吸附法、酶法等［2］.

柠檬苦素类物质是一类具有呋喃环的三萜类次生代谢产物，主要存在于柑橘属植物果实中，以柚皮柚核中含量最多，含量1%左右［3］.类柠檬苦素是柚皮和柚核中的主要活性物质之一.类柠檬苦素常以两种形式存在，一种为类柠檬苦素苷元，另一种为类柠檬苦素配糖体［4］，苷元是使柑橘类果汁产生后苦现象的重要原因之一.产生后苦现象的柚子汁严重降低了柚汁的食用品质和商用价值，极大地限制了柚子深加工产业的可持续发展.为了降低柚汁中柠檬苦素的含量，国内外学者提出和试验了多种降低柚汁柠檬苦素的方法.目前，已报道的主要柚汁柠檬苦素脱除方法有代谢脱苦［5］、屏蔽脱苦［6］、超临界 CO2脱苦［7］、β- 环糊精［8］、吸附脱苦［9-10］、酶法脱苦［11-12］等.吸附脱苦及掩饰脱苦是目前生产上常用的脱除柠檬苦素的方法，但吸附法容易造成柚汁其它营养物质（如VC）损失，且吸附剂易饱和、再生困难.而掩饰法脱苦效果不稳定［11］.酶法脱除柠檬苦素主要是通过不同的微生物发酵液或酶来分解柠檬苦素，生成不含苦味的物质.因此酶法脱苦不会破坏柚汁的风味和营养成分，且脱苦效果好，成本低，具有无毒性、效率高、反应条件温和及催化活力可被调节控制等优势［12-13］.

但由于商品酶高昂的价格，限制了酶法脱苦在柚子深加工产业的应用.因此，本研究通过从本地产柚子（粤北长坝沙田柚）中分离出的黑曲霉（Aspergillus niger）用于制作发酵粗酶液，分别采用单因素试验和正交试验考察黑曲霉发酵粗酶液（以下简称粗酶液）对柚子汁中柠檬苦素的去除效率，以寻求开发成本低廉的酶法脱除柚汁柠檬苦素方法，为粤北长坝沙田柚深加工提供技术支持.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与仪器

长坝沙田柚购自某农贸市场，黑曲霉从长坝沙田柚中分离而得，分离所得黑曲霉贮存于英东食品学院微生物室.粗酶液通过培养该黑曲霉而得，经测定粗酶液的活性为1.09 U.实验过程中使用的主要化学试剂有三氯化铁、硫酸、无水乙醇、4-（二甲氨基）苯甲醛、石油醚、三氯甲烷和七水硫酸镁等，均为分析纯.

主要的实验仪器有可见分光光度计（722，上海市佑科仪器仪表有限公司）、振荡培养箱（PYX-250Z-B，广州科力仪器）、数显恒温水浴锅（HH-4，常州市金坛友联仪器研究所）等.

1.2 实验方法

1.2.1 柠檬苦素标准曲线

柠檬苦素标准曲线的绘制按文献［14］所述进行.本实验测得柠檬苦素标准曲线如图1所示.

图1 柠檬苦素标准曲线

1.2.2 样品中柠檬苦素的测定

柠檬苦素的定量分析采用对二-甲氨基苯甲醛比色法［15］.粗酶液对柚汁中柠檬苦素脱除效果的评价，以柚汁中柠檬苦素的减少量表示.在粗酶液的作用下，柚汁中柠檬苦素减少越多，脱苦率越大，脱苦效果就越好.脱苦率计算方式为式中，D为柠檬苦素脱除率；C0为柚汁中柠檬苦素含量；C1为粗酶液处理后柚汁中柠檬苦素含量.

1.2.3 酶活的测定

稀释柠檬苦素标准液的质量-体积浓度为150 µg/mL.在粗酶液用量0.4 mL，温度45 ℃，pH值为6.0的条件下酶解2 h，根据柠檬苦素标准曲线计算出酶解后的柠檬苦素的含量.通过公式：酶活力=（X标-X样）×N/t，计算出酶活力［16］，式中（X标-X样）为黑曲霉发酵液水解柠檬苦素的微克数；t为酶解时间；N为柚苷酶样品的稀释倍数0.4.

1.2.4 单因素实验

固定粗酶液量0.4 mL、酶解温度45 ℃、摇床转速为100 rpm、酶解时间为2 h条件下，考察柚汁pH分别为3、4、5、6和7时，粗酶液对柚汁中柠檬苦素脱除率；固定粗酶液量0.4 mL、酶解温度45 ℃、摇床转速为100 rpm、柚汁pH为6条件下，考察酶解时间分别为1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h时，柚汁中柠檬苦素脱除率；固定酶解温度45 ℃、摇床转速为100 rpm、酶解时间为2 h和pH为6条件下，考察粗酶液添加量分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.2 mL时柚汁柠檬苦素脱除率；固定粗酶液量0.4 mL、pH为6、摇床转速为100 rpm、酶解时间为2.0 h条件下，酶解温度分别在25、35、45、55和65 ℃条件下柚汁柠檬苦素脱除率.

1.2.5 正交试验

通过单因素实验，筛选出对柚汁柠檬苦素脱除率影响最为显著的3个因素，设计3因素3水平正交试验，见表1，以优化粗酶液对柚汁中柠檬苦素脱除工艺的参数.

表1 L9（33）正交试验因素与水平

1.2.6 数据处理

本研究中所有实验均进行3次平行实验，取平均值作为实验结果.实验结果通过 Excel 2010 计算获得，并采用 Origin pro 9.0（Origin Lab，USA）绘制各实验因素对柚汁中柠檬苦素脱除率的影响曲线.

2 结果与讨论

2.1 不同pH条件下粗酶液对柚汁脱苦的影响

由图2可以看出，在pH值低于5时，柚汁中柠檬苦素脱除率随着pH值的升高而增大.当pH值为6，柠檬苦素脱除率达到36.8%，但pH值对柚汁柠檬苦素脱除率的影响不显著.本研究中柠檬苦素的脱除率低于张锦华等人采用柠檬苦素降解菌C6（Raoultella ornithinolytica）脱除柑橘汁中柠檬苦素的脱除率（91.28%），但处理时间为 12 h［17］.当 pH 高于6时，随着pH值的增大，柠檬苦素脱除率显著降低，其可能原因主要在于pH直接影响酶蛋白的构象，或影响底物和酶活性中心部位基团的解离，进而影响酶反应的速度，甚至导致柚苷酶变性而失活［18］.因此本研究中粗酶液对柚汁柠檬苦素脱除率在柚汁pH值为6时较佳.

2.2 不同酶解时间对柚汁脱苦的影响

如图3所示，随着酶解时间的延长，柠檬苦素脱除率增大，而在2.0 h后随着时间的延长，脱除率增加不显著，其主要原因是粗酶液中酶解柠檬苦素的酶活性较低，酶解时间超过2.0 h时酶基本消耗完全.故粗酶液对柚汁进行脱苦时，从节省能源，减少生产周期考虑，酶解时间以2.0 h左右为宜.

图3 酶解时间对柠檬苦素脱除效果的影响

2.3 不同粗酶液对柚汁脱苦的影响

由图4可知，柚汁的脱苦率先随着粗酶液的添加量的增加而增高，在添加量为0.4 mL时脱除率达到最大值43.5%，低于黄颖颖等人采用商品柚苷酶制剂对琯溪蜜柚汁中的柠檬苦素的脱除率（87.09%）［19］，这是由于本实验用的酶是粗酶液，未进行酶的纯化，其浓度不高.本试验为了探求粗酶液对柠檬苦素脱苦的效果，后续的试验会将酶液进行纯化，提高其生产的利用效率.但当粗酶液的添加量高于0.4 mL后随着添加量的增加脱除率先下降较快后减慢趋于平缓，出现该现象的原因是在柚汁脱苦加工处理过程中，黑曲霉的的培养基中含有柚皮粉，故其粗酶液中有苦味物质.因此，粗酶液的添加量为0.4 mL时，柠檬苦素的脱除率最大.

图4 粗酶液添加量对柠檬苦素脱除效率的影响

2.4 不同酶解温度对柚汁脱苦的影响

由图5可知，在温度25~45 ℃时，柠檬苦素的脱除率随着温度的上升而增大，脱苦率虽有所上升，但不显著，而在酶解温度为55 ℃时，柠檬苦素脱除率明显增大并达到最大值，而后脱除率随着酶解温度的上升而快速降低.主要原因是由于在较低温时随着温度的上升，酶活增大.但温度过高会使酶活性减弱、酶的稳定性降低，甚至会破坏酶原本的结构，引起变性［20］.故最佳酶解温度为55 ℃左右.

图5 酶解温度对柠檬苦素脱除效果的影响

2.5 正交实验

由单因素实验结果可知，柚汁pH、酶解时间、粗酶液添加量以及酶解的温度均对柚汁脱苦有影响，但影响程度不同（脱苦率在5%~41%之间）.柚汁pH的对柚汁中柠檬苦素脱苦效率的影响不明显.故在正交试验中，选择酶解时间、粗酶液添加量以及酶解的温度作为实验的因素.表2为粗酶液对柚汁中柠檬苦素脱苦工艺参数优化的结果.由表2可知，对于柠檬苦素脱除率，影响试验结果的主次顺序为C＞A＞B，最适组合为A2B3C2，即粗酶液对柚汁中柠檬苦素脱苦工艺的最适参数为酶液添加量为0.4 mL，酶解时间为3.5 h，柚汁温度为55 ℃.

表2 粗酶液对柑橘类果汁中柠檬苦素脱除的正交试验结果

2.6 验证试验

经过添加0.4 mL粗酶液，酶解温度为55 ℃，摇床转速为100 rpm和酶解时间为3.5 h的条件下进行验证试验，测得的柠檬苦素脱除率为42.0%，与预测结果相比差异不显著.

3 结论

本文分离产自本地沙田柚的黑曲霉，并成功用于产酶和对粤北长坝柚汁进行脱苦试验.结果表明粗酶液具有成本低廉及对柚汁中柠檬苦素具有较好的脱除效率的特点.在柚汁温度为55 ℃，酶解时间为3.5 h和粗酶液添加量为0.4 mL的条件下，对柚汁柠檬苦素的脱除率达41.9%，具有替代商品柚苷酶用于柑橘果汁脱苦的巨大应用潜力.但本研究中粗酶液未进行纯化，在后续的试验中可以通过纯化，提高其纯度以提高酶的脱苦率，并进一步明确酶液的主要活性成分.此外，由于柚子品种繁多，生长条件差异较大，所含苦味素成分及其含量也参差不齐.因此，黑曲霉产酶液对其它柑橘类果汁饮料的脱苦效率和适应性仍有待于进一步研究.