一种植物染色体制片改良方法

蒿若超,武美燕 (长江大学农学院,湖北荆州434025)

植物染色体制片技术是植物细胞遗传学、染色体工程、植物细胞生物学、植物细胞分类学和物种生物学等众多学科的基本实验技术[1,2]。目前,快速制备染色体临时片主要采用压片技术[3,4]。但是该实验操作步骤中压片要求较高的制片熟练程度,且乙酸洋红染色后,着色程度受乙酸洋红影响很大,染色体和细胞质不易区分,很难获得效果好的压片[5,6]。改良后的染色剂和制片方法克服了上述的缺点,对于初学者来说,不仅方法简便,还可获得效果很好的植物细胞染色体临时片。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以蚕豆 (Vicia f aba,2n=12)和玉米 (Zea mays,2n=20)雄穗为试材。

1.2 改良苏木精染色剂配制

A液:在100 mL锥形瓶中,用50 mL无水乙醇溶解2 g苏木精,摇动即可溶解。B液:在1 000 mL锥形甁中,用700 mL蒸馏水溶解20 g硫酸铝钾,使用磁力搅拌器即可快速溶解。将A液加入到B液中混合后,加入0.2 g碘酸钠 (NaIO3),摇动至颜色加深。最后加入20 mL冰醋酸,摇动颜色变为深葡萄酒红色,染液配制当日即可应用于染色。

1.3 染色体制片

(1)解离 将固定好的蚕豆根尖用蒸馏水冲洗3遍,吸干水分后放入1 mol/L的盐酸溶液中,在60℃水浴锅中解离18 min后,蒸馏水反复冲洗3遍,放在吸水纸上吸干。

(2)染色 将解离后的蚕豆根尖放入苏木精染色剂中染色10 min。染色后的植物根尖分生区呈深红色,非常方便切取。

(3)压片 将染色后的蚕豆根尖置于载玻片上,切取根尖分生组织1.5 mm,用尖头镊子将根尖压碎,加一滴苏木精,盖上盖玻片,用吸水纸压住盖玻片,再用铅笔的橡皮头垂直轻敲几下,最后用吸水纸吸干多余的染色液;取玉米雄穗1枚花药放在洁净的载玻片上,用镊子压碎花药,再滴1滴改良的苏木精染色液,盖上盖玻片,最后用吸水纸吸干多余的染色液。

2 结果与分析

2.1 改良苏木精与传统Harris's苏木精比较

同时配置两种苏木精染色液各1 000 mL,比较主要成分用量及配置时间,列于表1。结果表明,配置相同体积的2种苏木精染色液,配置改良苏木精染色液的各成分用量都小于配置传统Harris's苏木精染色液的用量。其中,传统Harris's苏木精染色液使用氧化汞作为氧化剂,改良苏木精染色液使用碘酸钠作为氧化剂;配置传统Harris's苏木精染色液需要2 d完成,而配制改良苏木精染色液只需20 min。原因硫酸铝钾的溶解度 (100 g H2O中)在0、10、20、30、40、60、80、90 ℃分别是3、3.99、5.9、8.39、11.7、24.8、71、109 g。故在冷却时,传统Harris's苏木精染液就会有硫酸铝钾沉淀析出,需在配置染色液的第二天进行过滤后,才能使用。

表1 2种苏木精染色液配制比较表

2.2 改良制片方法与常规制片方法比较

将改良制片方法与常规制片方法的主要细节进行比较,列于表2。从表2可以看出,解离步骤在2种方法中是相同的;在染色步骤过程中,常规方法使用醋酸洋红染色剂,且染色时要在火焰上加热煮沸3至6次。通常实验结果表明,醋酸洋红的染色效果不如苏木精的染色效果。学生在火焰上加热煮沸时,由于掌握不好时机,染色液容易沸腾蹦出,有较大的危险性。而在改良染色方法中,只需将植物材料浸泡在染色液中,不存在危险性;在压片过程中,常规压片是盖上盖玻片后用手指按压使细胞分散。在实验过程中,如果力度掌握不好,很容易把盖玻片压碎。在改良压片方法中,先用镊子将植物根尖压碎,使细胞分散,再盖上盖玻片。不需要再用手指压盖玻片,这样就不会将盖玻片压碎。

表2 改良制片方法与常规制片方法比较

2.3 改良苏木精的染色效果

图1是蚕豆根尖细胞有丝分裂在10×目镜下的观察图。图2是玉米雄穗花粉母细胞减数分裂在10×目镜下的观察图。从图1可以看出,首先在一个视野下出现较多的分裂相,便于学生观察。其次,使用改良苏木精染色后,染色体呈深红色,而细胞质背景呈透明色,使得染色体形态观察的非常清晰。从图2可以看出,玉米花粉母细胞减数分裂过程中四分体时期染色非常清晰。

图1 蚕豆根尖细胞染色体染色效果

图2 玉米雄穗花粉母细胞染色效果

3 讨论

植物根尖细胞染色体制片技术是遗传学实验中最常见的实验之一。按照传统实验方法进行根尖细胞染色体观察,往往由于实验中的很多细节没有掌握好,花费很长时间也做不出质量好的片子,因此要求实验人员改进染色方法和改良染色剂,以求达到通过简单的几个操作,就能做出质量较好的染色体片子。

传统的Harris's苏木精染色液配置需要 “成熟”2个月才能使用,且放置长时间后出现很多沉淀,给制片带来很多麻烦。本研究中,染色液通过采用强氧化剂碘酸钠,加速苏木精氧化,达到染色液当天配置当天使用,不需等待很长时间。同时,减少媒染剂硫酸铝钾用量,基本低于硫酸铝钾的溶解度,避免了染色液在配置长时间后析出沉淀的问题。

传统的压片技术操作过程中,压片的力度要求有较高的熟练程度才能既把染色体分散开,又不会把盖玻片压破。而改进的操作是直接用镊子压碎材料后再放盖玻片。这样染色体分散均匀,又同时还可以防止盖片被压碎。

通过改良的植物根尖细胞染色体制片方法,使染色体制片实验变的相对简单易做,而且该方法用于不同植物材料的染色体制片中,效果都较好。

[1]李懋学,张赞平.作物染色体及其研究技术 [M].北京:中国农业出版社,1996.1-40.

[2]李懋学,张敩方.植物染色体技术 [M].哈尔滨:东北林业大学出版社,1991.1-53.

[3]朱 微.植物染色体及染色体技术 [M].北京:科学出版社,1982.42-87.

[4]祝水金.遗传学实验指导 (第2版)[M].北京:中国农业出版社,2005.14-17.

[5]詹少华.大豆根尖染色体制片实验的教学改革[J].皖西学院学报,2009,25(2):65-67.

[6]陈 高,孙 航,孙卫邦.改进的植物染色体制片方法[J].植物生理学通讯,2007,43(4):65-67.